Зменшення водного стресу та стимулювання розвитку цукрових буряків за допомогою ризобактерій (частина 1)
Стрес, викликаний посухою, негативно впливає на врожайність та цукристість буряків, обмежуючи розвиток листя та коренів солодкої культури. У даній статті було досліджено вплив інокуляцій дев'яти видів бактерій, які продукують гетероауксин (ІУК), фіксують N2, солюбілізують неорганічний фосфат (P) та містять 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат деаміназу, на врожайність та морфофізіологічні параметри цукрових буряків в умовах п’яти різних режимів зрошення. Зменшення подачі води викликало поступове сповільнення росту рослин, зменшення вмісту хлорофілу, маси кореня та листя, а також вмісту цукру, що супроводжувалося активізацією індикаторів стресу, викликаного посухою (гетероауксину, глутатіон-S-трансферази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, 6-фосфатоглюконатдегідрогенази, малондіальдегіду та перекису водню). Незважаючи на залежність від водних режимів та бактеріальних штамів, результати експериментів показали, що інокуляції бактеріями стимулювали ріст рослин, включаючи ферментативну активність, вміст цукру, розвиток листового апарату та коренеплоду, вміст хлорофілу в листі, N, P, K, Са, Mg, Na, Mn та Zn, але зменшили вміст малондіальдегіду (MDA) та H2O2, що може частково сприяти активізації процесів, пов'язаних зі зменшенням впливу водного стресу.
За матеріалами статті в галузі прикладної екології та екологічних досліджень на тему «Зменшення водного стресу та стимулювання росту цукрових буряків (Beta vulgaris L.) ризобактеріями» («Alleviation of water stress and promotion of the growth of sugar beet (Beta vulgaris L.) plants by multi-traits rhizobacteria») (листопад 2018).
Цукровий буряк (Beta vulgaris L.) є дуже важливою промисловою культурою, найбільш вагомим фактором для його виробництва є мінеральні добрива. Виробництво цукрових буряків потребує значної кількості води, але останнім часом водний стрес став серйозним обмеження у вирощуванні цієї культури, викликаючи помітне зниження її продуктивності. Посуха характеризується зниженням вмісту води та є одним із найпоширеніших факторів навколишнього середовища, які негативно впливають на продуктивність рослин. Під час посухи вміст води в листі зменшується і, відповідно, погіршується тургор. Як результат, пори закриваються, зменшується ріст клітин та врожайність. Посуха гальмує процес фотосинтезу і, таким чином, погіршує ріст та розвиток рослин. Водний стрес зменшує виробництво сухої речовини і вважається одним з основних обмежуючих факторів для розвитку листя та кореня цукрового буряка. Таким чином, посуха досить сильно впливає на накопичення цукру та процес фотосинтезу, так як зі збільшенням дефіциту води активність цих процесів зменшується.
Ризобактерії, що стимулюють ріст рослин (PGPR), покращують багато фізіологічних, живильних, морфологічних та біохімічних реакцій рослин, і, таким чином, підвищують їх стійкість до абіотичних та біотичних стресів. Інокуляції відібраних посухостійких штамів бактерій можуть зменшити скорочення врожайності, викликане дефіцитом води, та покращити стійкість рослини до стресу, викликаного посухою. У зв'язку з цим, використання ризобактерій у вирощуванні цукрових буряків розглядається як альтернатива, що стимулює стійкість рослин до стресу. PGPR можуть фіксувати азот, солюбілізувати неорганічний фосфат, генерувати 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат деаміназу та гетероауксин (ІУК) та підтримувати розвиток рослин. Бактерії, які містять 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат деаміназу, можуть зменшити негативний вплив етилену, який викликає водний стрес. Якщо в стресових умовах, коли виробництво «стресового» етилену збільшується, бактерії, які містять 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат деаміназу, перешкоджають його синтезу, і рослини можуть знижувати рівень етилену, що забезпечує їх захист від інгібуючого впливу стресу.
Щоб збільшити виробництво цукрових буряків необхідні ризобактерії, які стимулюють ріст рослин. Окрім того, існує декілька досліджень, в яких у боротьбі з водним стресом застосовуються ризобактерії. У зв’язку з обмеженням водних ресурсів збільшується необхідність використання різних підходів для забезпечення ефективнішого використання води. Саме з цієї причини було досліджено вплив різноманітних видів бактерій, які містять 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат деаміназу, виробляють гетероауксин, фіксують N2 та/або солюбілізують неорганічний фосфат, на ріст, антиоксидантні та пентозофосфатно-окислювальні ферменти, врожайність та якість цукрових буряків під час різних режимів зрошення (150%, 100%, 75%, 50% та 25% водозатримувальної здатності (WHC)). У даному дослідженні в умовах обмежених водних режимів основною метою було зменшити втрати якості та ефективності, в залежності від стресу, та підвищити стійкість цукрових буряків до водного стресу за допомогою ризобактерій, що стимулюють ріст рослин.
Матеріали та методи
Види бактерій
Бактеріальні види Bacillus subtilis RC11, Bacillus subtilis RC63, Pseudomonas fluorescens T26, Rhodococcus erythropolis RC9 та Variovorax paradoxus RC21 були виділені з ризосфери дикорослої малини, а Paenibacillus polymyxa RC05 — з пшениці. Інші три штами (Pseudomonas putida RC310, Pseudomonas fluorescens PF8/6 та Bacillus megaterium A21/3) були виділені з ризосфери чайних рослин. Деякі особливості бактерій, які використовувалися в експерименті, наведені в Таблиці 1.
Таблиця 1. Особливості бактерій, які були задіяні в процесі дослідження
| Використаний бактеріальний ізолят | Виробництво 1-аміноциклопропан-1-карбоксилату (мкг мл-1 OD600 одиницю-1) | Активність нітрогенази (нмоль C2H4, 107 КУО год.-1) | Солюбілізація неорганічного фосфату (мкг P мл-1 d-1) | Активність 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат деамінази (нмоль α-кетобутирату мг-1 білка год.-1) |
| Rhodococcus erythropolis RC9 | 22.6 ± 1.5 | 0.55 ± 0.11 | 27.8 ± 1.5 | 577.8 ± 26.7 |
| Pseudomonas fluorescens T26 | 23.9 ± 2.1 | 0.61 ± 0.13 | 27.7 ± 1.2 | 796.1 ± 35.2 |
| Paenibacillus polymyxa RC05 | 32.8 ± 2.6 | 0.68 ± 0.14 | 10.1 ± 0.9 | 682.1 ± 33.7 |
| Bacillus subtilis RC11 | 29.4 ± 1.8 | 0.32 ± 0.12 | 16.6 ± 0.4 | 539.2 ± 21.2 |
| Variovorax paradoxus RC21 | 19.4 ± 1.2 | 0.47 ± 0.12 | 35.7 ± 2.1 | 332.6 ± 17.4 |
| Pseudomonas putida RC310 | 25.9 ± 2.4 | 0.56 ± 0.15 | 26.8 ± 1.8 | 746.2 ± 46.8 |
| Pseudomonas fluorescens PF8/6 | 20.7 ± 1.5 | 0.47 ± 0.09 | 113.5 ± 12.7 | 223.6 ± 21.7 |
| Bacillus subtilis RC63 | 29.7 ± 1.9 | 0.74 ± 0.17 | 34.6 ± 0.08 | 972.0 ± 28.3 |
| Bacillus megaterium A21/3 | 19.5 ± 1.1 | 0.48 ± 0.16 | 74.3 ± 1.9 | 276.3 ± 16.7 |
*Дані з Таблиці 1 — середні значення ± стандартна похибка трьох досліджуваних зразків.
Експерименти та умови росту
Дослідження було проведено в умовах природного освітлення в теплиці Факультету сільського господарства Ататуркського державного університету (м. Ерзурум, Туреччина), цукрові буряки вирощувалися в теплиці, при цьому протягом початкового періоду тривалість світлового дня складала 14 год., температура — від 15 до 25°С та вологість — 60%, а протягом періоду освоєння тривалість світлового дня збільшилася до 15 год., температура склала 16-28 °С і відносна вологість — 55-60%. Два різні зразки були відібрані як факторний експерименту рандомізованій повно блоковій схемі з п'ятьма копіями. Всього в обох досліджуваних зразках налічувалося по 11 варіацій: (1) контроль (без застосування бактерій та мінеральних добрив), (2) азотно-фосфорні добрива (55 мг N + 40 мг P/кг ґрунту), (3) R. erythropolis RC9, (4) P. fluorescens T26, ( 5) P. polymyxa RC05, (6) B. subtilis RC11, (7) V. paradoxus RC21, (8) P. putida RC310, (9) P. fluorescens PF8 / 6, (10) B. subtilis RC63 та (11) B. megaterium A21/3, а також п’ять водних режимів, розподілені хаотичним способом. Ґрунт являв собою супіщані мулові суглинки з вмістом органічної речовини 3,2%, 7,6 pH, вмістом наявного фосфору за Ольсеном 16,2 мг кг-1 та загальним вмістом азоту (N) 15,7 мг кг-1. Змінні K, Ca, Mg і Na склали 448, 3420, 472 і 78 мг кг-1, а вміст Fe, Mn, Zn та Cu склали 5,9, 9,6, 1,2 та 1,7 мг/кг.
Досліджувалися цукрові буряки, які були повністю забезпечені необхідною кількістю води (100% водозатримувальної здатності (WHC)), перезволожені буряки (150% від максимальної WHC), безперервно помірно зрошувані буряки (75% та 50% WHC) та буряки, які відчували сильний дефіцит води (25% WHC). На початку експерименту усі зразки буряків ретельно зрошувалися для визначення водозатримувальної здатності (WHC) кожного з них, після чого їх накривали для запобігання випаровування та залишали для гарного дренажу. Потім вони зважувалися та визначалася WHC. Одразу після посадки цукрові буряки зрошувалися з коефіцієнтом 65 ± 5% WHC, щоб забезпечити проростання та підтримку перших сходів протягом 3 тижнів після посіву, потім в обох піддослідних зразках почали застосовувати різні рівні поливу. Рівень зрошення визначався відповідно до наявної в ґрунті вологи. За допомогою цього методу (визначення наявної вологи в ґрунті та рівня вологи, який може визначити WHC для певного ґрунту) було визначено різні співвідношення для доповнення втраченої вологи. Зразки перевірялися кожні три дні, кількість зрошувальної води визначалася відповідно до ємності горщиків, у яких росли буряки.
Через два тижні після посадки сходи проріджували, під час першого експерименту в кожному горщику залишалося по 5 рослин протягом п’яти листового періоду, а в другому експерименті залишалася 1 рослина в семи листовий період. Використовуючи прилад SPAD-502 («Мінолта», Японія), визначався вміст хлорофілу в кожному четвертому та п’ятому листку. Перші результати експерименту було отримано через 65 днів після посіву, а наступні результати дослідження отримали через 130 днів після посадки. Вміст цукру в буряках визначався під час їх збирання, і він виражався у масі на рослину.
Визначення ферментативної активності та концентрації білка
Листя тричі промивалося та підлаштовувалося під 8,0 pH, використовуючи рідкий азот, відібрані зразки рослин гомогенізували. Активність глутатіонредуктази (EC 1.8.1.7), глутатіон-S-трансферази (EC 2.5.1.18), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (EC 1.1.1.49) та 6-фосфоглюконатдегідрогенази (EС 1.1.1.44) визначалися відповідно до Карлберга та Маннервіка (1985), Хабіга та Якобі (1981) та Бетлера (1984). Активність кожного ферменту визначалася спектрофотометричним способом (Спектрофотометр Shimadzu UV-1208, Кіото, Японія) при 25 °C. Концентрація білка визначалася за методом Бредфорда (1976) за допомогою вимірювання абсорбції 595 нм із використанням альбумін бичачої сироватки у якості стандарту.
Визначення H2O2 та MDA
Вміст перекис водню (H2O2) визначався за методом, описаним Сайрамf та Срівастава (2002). Густина H2O2 визначалася спектрофотометрично, шляхом зчитування абсорбції комплексу гідроперекису титану та обчислювалася за допомогою стандартної кривої з урахуванням відомої концентрації H2O2. Перекисне окислення ліпідів визначалося шляхом визначення вмісту малодіальдегіду (MDA) у масі свіжого листя за методом Хіта та Пейкера (1968), приготованого в 10% трихлороцтовій кислоті, що містить 0,65% 2-тіобарбітурової кислоти (TBA), і нагрівалося при 95 °C протягом 25 хв, а потім швидко охолоджувалося. Концентрація MDA розраховувалася з абсорбції при 532 нм і виражалася як нмоль г-1 свіжої маси (FW).
Вміст макро- та мікроелементів у листі цукрових буряків
Відібрані зразки листя висушувалися при 68 °С протягом 48 год. і подрібнювалися на 1 мм шматочки. Загальний вміст азоту (N) визначався за допомогою методу К'єльдаля з використанням апарату для перегонки Vapodest 10 («Gerhardt», м. Кенігсвінтер, Німеччина). Після процесу екстракції макро- (P, K, Ca і Mg) та мікроелементи (Fe, Mn, Zn і Cu) були виявлені за допомогою індуктивно зчепленого плазмового спектрофотометру (Optima 2100 DV, ICP/OES, «PerkinElmer», м. Волтгем, Массачусетс, США).