За матеріалами публікації Американського товариства інженерів сільського господарства та біології (ASABE) на тему «Зберігання соку промислових буряків із використанням органічних кислот» («Preserving Juice from Industrial Beets Using Organic Acids»), січень 2019 р.

Промислові буряки можуть бути сировиною для виробництва біопродуктів (включаючи біопаливо) і, таким чином, стимулювати економіку сільського господарства. Промислові буряки — це цукрові буряки (Beta vulgaris L.), які вирощуються для непродовольчого використання. Цукрові буряки можуть рости на засолених ґрунтах, неродючих для інших культур, і мають важливі переваги перед зерном кукурудзи, основним джерелом ферментованих цукрів у США. Наприклад, із буряків можна отримати швидко ферментовані цукри, зменшуючи потребу в енергоємних стадіях, необхідних зерну кукурудзи для гідролізу крохмалю. Більше того, у 2017 році середній вихід цукру промислових буряків досягнув 12,6 т/га^-1 в еквіваленті гексози (NDSU, 2014), тоді як кукурудзи — 7,4 т/ га^-1 (USDA-ERS, 2018).

Успіх промислових буряків значною мірою залежить від розробки енергоефективних систем зберігання та утримання цукру. Високий вміст вологи в буряках створює проблеми для їх ефективного транспортування та зберігання. Нові методи зберігання показали задовільне утримання цукру для непродовольчої ферментації. Більше того, вуглецевий слід при транспортуванні, зберіганні та переробці промислових буряків у ферментовані цукри вдвічі менший, ніж при переробці зерна кукурудзи: 0,51 кг еквівалента СО₂ на 1 кг моносахариду для промислових буряків від поля до підкисленого згущеного соку проти 1 кг еквіваленту СО₂ на 1 кг моносахариду для зерна кукурудзи від поля до неконцентрованого цукрового розчину. Нові методи можуть додатково зменшити витрати енергії та хімічних речовин, необхідних для переробки буряків, тим самим зменшивши вартість та ризики зберігання, а також негативний вплив на навколишнє середовище. Мікробні метаболіти, що підтримуються шляхом первинної ферментації бурякової тканини, можуть допомогти зберегти чистий вихід біопродуктів із буряків і, тим самим, зменшити потребу в додаткових хімічних речовинах. Після зберігання метаболіти та залишковий цукор можуть бути перетворені в біопродукт на кінцевому етапі ферментації.

Сучасні системи виробництва, зберігання та переробки цукрових буряків розроблені з метою отримання високоочищеної їстівної форми сахарози, яка може конкурувати з тростинним цукром на ринку столового цукру. Щодо цього, присутність глюкози та фруктози в соку є небажаною умовою, яка обумовлює необхідність багаторазових енергоємних етапів очищення; таким чином, сучасні системи спрямовані на утримування глюкози, фруктози та інших домішок на якомога нижчому рівні. Крім того, переробні системи простоюють по кілька місяців через обмеження систем зберігання. Однак, якщо буряк є вихідною сировиною для біопалива або інших біопродуктів, тоді до виробництва, зберігання та переробки можна ро-різному підходити. Це пов’язано з тим, що глюкоза та фруктоза так само легко ферментуються, як і сахароза, а інші домішки, особливо амінозот, можуть посилювати їх перетворення. Тому виробничі системи модернізуються, щоб максимізувати загальний вихід ферментованого цукру. Системи зберігання можуть забезпечувати перетворення сахарози на глюкозу та фруктозу і, зрештою, підтримувати цілорічні переробні кампанії. Крім того, у процесі виробництва кінцевого біопалива або біопродукту зникне потреба в енергоємних етапах очищення сахарози, включаючи карбонування кальцію та багаторазову повторну кристалізацію сахарози.

Нещодавнє дослідження показало, що за умов рН £ 4 та вмісту твердих речовин ³ 64,5% було досягнуто утримання понад 90% загального ферментованого цукру протягом 24 тижнів у сирому буряковому соку та вісім тижнів у буряковій тканині. Крім того, при кондиціонуванні соку до та після зберігання бродіння дріжджів (Saccharomyces cerevisiae) не зменшується. Натомість процес бродіння дріжджів після зберігання можна поліпшити за допомогою солей амонію, синтезованих у результаті нейтралізації та підкислення соку. Для зберігання сік спочатку концентрують за допомогою високоенергоефективного багаторазового випарювання. Це зменшує транспортні витрати та слід зберігання, але тягне за собою більші витрати на обладнання та резервуарне зберігання, порівняно з транспортуванням та зберіганням бурякової тканини. Однак досягнення стабільного зберігання бурякового соку або тканини вимагає додавання неорганічної кислоти, такої як сірчана кислота та/або дегідратації соку або тканини. Припускаючи, що вартість сірчаної кислоти становить 200 дол./т, витрати кислоти (на основі сухого цукру) для утримання цукру в тканині буряка можуть складати до 10 дол./т. А нейтралізація кислоти після зберігання призвела б до додаткових витрат.

Центральна гіпотеза дослідження полягає в тому, що мінеральні кислоти, такі як сірчана або соляна кислота, які іноді використовують для регулювання рН при зберіганні бурякового соку, можуть бути частково або навіть повністю замінені ферментацією, яка перетворює частину цукру в метаболіт, такий як органічна кислота. Органічна кислота зменшує рН до рівня, який гальмує ріст мікроорганізмів, тим самим зберігаючи залишковий цукор, який не використовується для виробництва органічної кислоти або для забезпечення мікробної активності. Після завершення зберігання умови ферментації будуть оптимізовані з метою повного перетворення метаболіту та залишкових цукрів у бажаний кінцевий продукт. Метаболіт, який забезпечує утримання під час зберігання, може бути бажаним кінцевим продуктом або служити субстратом для ферментації. У разі успіху, цей підхід органічних кислот значно зменшить витрати на зберігання та буде більш сумісним із ферментацією, порівняно з підходом мінеральної кислоти/дегідратації, та може гарантувати цілорічну переробку бурякового соку.

Протягом тисячоліть люди використовували органічні кислоти у якості харчових консервантів. Оцтова та молочна кислоти — дві загальновживані органічні кислоти, що використовуються для консервування їжі. Молочна кислота в чистому вигляді також цінна як сировина для виробництво ПЛА-пластику (полілактидний, біорозкладний). Список комерційно цінних органічних кислот, які можна отримати шляхом ферментації, довгий і включає піровиноградну, молочну, лимонну, бурштинову та адипінову кислоти. Консервуюча дія органічних кислот пояснюється як зниженням рН, так і їх здатністю проникати в мікробні мембрани у зв’язку з їх ліпофільною природою. Крім того в сприятливих умовах навколишнього середовища та з відповідним ферментативним мікроорганізмом кислоти можуть перетворюватися в інші цінні продукти. Піровиноградна кислота є одним із прикладів метаболіту органічної кислоти, який безпосередньо цінний як консервант, але також може легко використовуватися генетично модифікованими мікроорганізмами для перетворення в інші продукти. Прикладом цього є виробництво етанолу через спиртдегідрогеназу та піруватдекарбоксилазу з модифікованою кишковою паличкою. Подібним чином, біопаливо бутанол можна отримати шляхом поглинання масляної кислоти Clostridium acetobutylicum після утворення кислоти під час кислотогенної фази ферментації. Хоча використання органічних кислот як консервантів не є новим методом, їх контрольоване використання для зберігання промислових буряків для подальшої ферментації є досить новим підходом. Однак, для успіху цього підходу, ферментація та зберігання не повинні бути енергоємними та суттєво зменшувати вихід кінцевих продуктів. Одним із енергоємних процесів є концентрування бурякового соку приблизно до 70% рефрактометрично розчинених твердих речовин (RDS) перед зберіганням, хоча значно нижча концентрація RDS забезпечить краще вихідне середовище для розвитку кислотопродукуючих мікроорганізмів. Виникає лише одне запитання — чи зможуть органічні кислоти зберігати буряковий сік при набагато нижчих коефіцієнтах RDS, таких як 25%? Отже, метою даної роботи є перевірка кількох потенційно ефективних органічних кислот на їх здатність забезпечувати утримання бурякового цукру при 25% RDS.

Таблиця 1. Короткий огляд змінних трьох експериментів зі зберігання бурякового соку

Результати та обговорення

Підкислення бурякового соку різними концентраціями органічної кислоти

Органічні кислоти — це, як правило, слабкі кислоти, які не дисоціюють повністю в розчинах. Сила цих органічних кислот змінюється залежно від їх здатності дисоціювати. Щоб закласти деякі основи для цих експериментів, важливо було зрозуміти, наскільки рН бурякового соку змінюється з кожним типом кислоти при різних їх концентраціях. Ці зміни пов'язані з кількістю та властивостями кислоти. Серед шести кислот, використаних у дослідженні, оцтова, пропіонова та масляна — це прості прямоланцюгові аліфатичні кислоти, які відрізняються лише числом вуглецевих атомів, тобто оцтова = С2, пропіонова = С3 та масляна = С4.  Криві підкислення цих трьох кислот (Рис. 1а) демонструють подібне експоненціальне зниження рН при збільшенні молярної концентрації кислоти. Криві пересікаються, що вказує на те, що молярні частки кислоти, необхідні для досягнення цільового рівня pH, будуть приблизно однаковими при використанні цих трьох кислот.

Рис. 1. Криві рН бурякового соку, підкисленого (а) трьома аліфатичними кислотами, що мають різне число вуглецевих атомів, та (b) трьома органічними кислотами з однаковим вуглецевим числом (С3) при різних пропорціях кислоти до розчинених твердих речовин

Таким чином, довжина вуглецевого ланцюга майже не впливала на силу цих трьох кислот. Відомо, що електрон-вивільняючий ефект алкільної групи є подібним для цих кислот. Іншими словами, електронегативність кислоти не сильно залежить від довжини алкільної групи. Оцтова кислота має найменшу молярну масу серед цих кислот та є найефективнішою для зниження рН на масовій основі. Криві на Рис. 1а також показують, що неможливо досягти рН набагато нижче 3,0 за допомогою цих трьох кислот, оскільки криві мають тенденцію до рН 3,0. Неможливо провести експеримент нижче рН 3,0 із використанням цих кислот.

Криві підкислення трьох С3 органічних кислот із різними додатковими функціональними групами на С2 (пропіонова, молочна та піровиноградна) чітко відрізняються одна від одної (Рис. 1b). Наявність гідроксильної групи С2 у молочній кислоті та кетону С2 у піровиноградній кислоті забезпечують сильний електронегативний вплив на карбонову групу; отже, ці кислоти легше дисоціюють у розчині, порівняно з пропіоновою кислотою. Електронегативний вплив сильніший для кетонової, а не для гідроксильної групи, завдяки чому піровиноградна кислота є найсильнішою кислотою серед групи на Рис. 1b. Це дозволяє знизити рН до рівня, порівнянного з неорганічною кислотою. Експоненціальне зниження рН бурякового соку, підкисленого молочною кислотою на Рис. 1b, подібне до підкислення біологічного матеріалу за допомогою Lactococcus lactis. Крива підкислення лимонної кислоти не включена на Рис. 1b; проте вона була між молочною та пропіоновою кислотами. Навіть маючи триосновну природу, лимонна кислота не така сильна, як піровиноградна. На відміну від оцтової, масляної та пропіонової кислот, за допомогою яких неможливо досягти рН набагато нижче за 3, рН нижче 3 легко досягається за допомогою молочної, лимонної та піровиноградної кислот. Піровиноградна кислота є найефективнішою з шести кислот як за молярною, так і за масою частками. Для того, щоб досягти подібних рівнів рН незалежно від використовуваної кислоти, найнижчий рівень рН був встановлений на рівні 3,5. Кількість кожної кислоти, необхідної для досягнення двох цільових значень рН (4,5 і 3,5), наведена в Таблиці 2.

Якщо розглядати кількість кислоти, необхідної для досягнення рН 4,5, лимонна, молочна та піровиноградна кислоти потребують менших кількостей (у 3-5 разів меншу на молярній основі), порівняно з оцтовою, масляною та пропіоновою кислотами. Цікаво, що кількість кожної алкільної кислоти дуже подібна, і навіть кількості інших трьох кислот (лимонної, молочної та піровиноградної) досить близькі одна до одної. Різниця збільшується, коли рН наближається до 3,5. Наприклад, молярні частки кислоти, необхідні для досягнення рН 3,5, у піровиноградній, лимонній та молочній кислоті в 6-13 разів менші, порівняно з трьома алкільними кислотами. Чим нижчий цільовий рН, тим більша різниця спостерігається серед кислот, навіть тих, що мають подібну силу. Кількість (молярна частка) кислоти, необхідна для досягнення кожного з цільових значень рН, показує позитивний зв’язок зі значеннями константи іонізації (рКа). Оцтова, масляна та пропіонова кислоти мають подібні значення рКа ≥ 4,74. На відміну від цього, молочна та піровиноградна кислоти мають значення рКа ≤ 3,86. У цьому порівнянні, для лимонної кислоти було використано найнижче з трьох значень рКа. Таким чином, якщо в майбутньому розглядати інші органічні кислоти, їх значення рКа будуть важливим орієнтиром для прогнозування кількості, необхідної для регулювання рН.

Перш ніж дослідити можливість досягнення цих рівнів рН за допомогою кислотопродукуючого мікробного процесу, важливо визначити стабільність сахарози в буряковому соку з часом при регулюванні до початкового цільового рН за допомогою цих кислот. Початкові цільові рівні рН були в межах від 4 до 6,5, в яких можуть виживати деякі кислотопродукуючі мікроорганізми, за винятком найнижчого початкового рівня рН 3,5 в експериментах 2 та 3.

Таблиця 2. Кількість органічних кислот, необхідна для регулювання 25% RDS в буряковому соку до цільового рН 4,5 та 3,5, значення константи іонізації (рКа) та молярної маси

Дослідження зберігання бурякового соку

Експеримент 1

Перший експеримент зберігання був розроблений, щоб визначити, чи можна зберігати цукри при кімнатній температурі з мінімальним регулюванням рН. Було обрано два відносно високі початкові рівні рН (5,3 та 4,5). Крім того, протягом зберігання аналізували лише рН та RDS, сподіваючись, що ці легко отримувані дані дадуть адекватні показники мікробної активності та утримання цукру в соку. Ідея полягала у використанні цих двох вимірюваних значень разом із візуальними доказами, щоб швидко оцінити установку та перевірити найбільш ефективні органічні кислоти для подальшого більш достовірного дослідження. Початковий показник RDS 25,5% ± 0,7%, що застосовувався у всіх експериментах, вимагав, щоб буряковий сік піддавався незначній концентрації шляхом випаровування, щоб зменшити необхідний обсяг зберігання та, можливо, підвищити стабільність сахарози. Незважаючи на те, що концентрація викликає витрати енергії, потреба в енергії може бути значно зменшена за допомогою рекомпресії пари або багаторазового випаровування.

Результати для зразків, що зберігалися при рН 5,3, і контрольного зразка чітко показують, що всі вони швидко зіпсувалися (Таблиця 3). Це видно з різкого зниження рН до 4,6-4,9 до 10-го дня зберігання у більшості зразків. Зниження рН до 21-го дня не суттєво відрізнялося (р < 0,001) від зниження рН до 10-го дня, особливо для контрольного зразка та зразків, підкислених молочною, пропіоновою та лимонною кислотами. Також спостерігалося зменшення рефрактометрично розчинених твердих речовин (RDS), яке, як правило, було більшим на 21 день, ніж на 10 день зберігання. Більше зменшення RDS до 21-го дня свідчить про продовження поглинання цукру, навіть незважаючи на мінімальну зміну рівня рН. Контрольний зразок та зразки, підкислені оцтовою, пропіоновою та лимонною кислотами, мали каламутний та бульбашковий вигляд. Бульбашки вказували на виділення газу, що призвело до того, що пробки зламалися або вискочили до 10-го дня зберігання, пропускаючи повітря всередину зразків. Це підтвердило деформацію пробок у наступних експериментах.

При початковому рН 4,5 зразки демонстрували незначну зміну або зовсім не змінювали рівень рН (зменшення на 0,2) протягом 21 дня зберігання, що свідчить про достатню стабільність зразків. Крім того, у цих зразках не було видимих ознак псування, оскільки помутніння було водсутнім, а пробки — цілими. Рефрактометрично розчинені тверді речовини (RDS) у зразках, підкислених масляною, пропіоновою, оцтовою та піровиноградною кислотами, залишалися стабільними на 10 день, проте в зразках, підкислених лимонною та молочною кислотами, RDS зменшилися більше ніж на 9%. Однак RDS значно зменшилися (~ 8%) у всіх зразках до 21 дня зберігання, за винятком зразків, підкислених масляною кислотою (зниження на 2%). Це зменшення RDS вказує на активність мікроорганізмів, всупереч рН та видимим ознакам, а також те, що в більшості випадків кислоти не змогли зберегти цукрові буряки.

Очікувалася значна відповідність між рН та RDS. Зниження рН свідчить про псування бурякового соку через активність лужноутворюючих мікроорганізмів, під час якої цукри, ймовірно, перетворюються на органічні кислоти. Тому, також очікувалося зменшення RDS разом зі зменшенням рівня pH. Однак зниження рН не корелювало (r = -0,234, p = 0,442) зі зниженням RDS. Наприклад, контрольний зразок мав різке падіння рН, але мінімальну зміну RDS (-1,5%); на відміну від цього, зразки, підкислені до рН 4,5, демонстрували мінімальну зміну рН, але значну зміну RDS (до 15%). У свіжому буряковому соку розчинені тверді речовини представляють здебільшого сахарозу, а також нецукрові компоненти. Невелике зменшення RDS, яке спостерігалося в контрольному зразку, незважаючи на значне падіння рН, могло бути наслідком органічних кислот, що утворюються в результаті циклу трикарбонових кислот (циклу Кребса) в результаті діяльності мікроорганізмів, які все ще вимірювалися рефрактометром як розчинені тверді речовини. Отже, рН та RDS були важливими показниками активності мікроорганізмів, але RDS були більш чутливим показником при низькому рН.

Перший експеримент показав, що масляна кислота була найефективнішою із шести органічних кислот у зберіганні бурякового цукру. Однак інші п’ять кислот можуть бути ефективними при нижчому початковому рН, а вдосконалення методології зберігання також може бути корисним. Оскільки пробки зламалися до 10-го дня в контрольному зразку та в декількох зразках при рН 5,3, у кожну пробірку був вмонтований зворотний клапан для вивільнення газів, що утворюються мікроорганізмами, для підтримання анаеробних умов та збереження цілісності пробки. Крім того, відбір зразків із пробірок у проміжний час (день 10) призвів до потрапляння свіжого повітря всередину зразків, що могло вплинути на достовірність отриманих результатів. Другий експеримент був розроблений для вирішення цих питань.

Таблиця 3. Зміна рН та рефрактометрично розчинених твердих речовин (RDS) на 10 і 21 день зберігання підкисленого бурякового соку, що зберігався при 22,5°C в експерименті 1^(a)

(а) Значення, які означають два повтори. Зміни pH та RDS — це різниця між значеннями, вимірюваними на 10 та 21 день, порівняно з днем 0.

(b) Парне порівняння Тьюкі показало, що значення рН (4,6 - 4,9) були однаковими для 10-го та 21-го днів.

(c) Парне порівняння Тьюкі показало, що лише зміна RDS була різною на 10-й день для зразків, підкислених лимонною кислотою. На 21 день зміна RDS була однаковою, незалежно від використовуваної кислоти.

Експеримент 2

Другий експеримент був розроблений для перевірки нижчого початкового рівня рН за допомогою вдосконаленої методології зберігання; отже план дослідження враховував лише три органічні кислоти: масляну (найефективнішу кислоту в експерименті 1), оцтову (недорогу кислоту) та піровиноградну, яка була дуже ефективною для зменшення рН при невеликих кількостях (Рис. 1b). Зміни рівня рН, рефрактометрично розчинених твердих речовин (RDS) та маси після 31 дня зберігання представлені в Таблиці 4. Не було значної різниці (р > 0,05) між значеннями, вимірюваними протягом трьох різних днів (на 10, 24 та 31 день); тому в Таблицю 4 включено лише дані за 31 день. Зміни, які були виявлені в більшості зразків, відбулися протягом перших 10 днів зберігання, а потім залишалися стабільними до 31 дня.

Таблиця 4. Зміни рівня рН, рефрактометрично розчинених твердих речовин (RDS) і маси підкисленого соку буряка, що зберігався при 22,5°C протягом 31 днів^(а)

(а) Значення, які означають три повтори, стандартні відхилення становили від 0,01 до 0,34. Зміни pH та RDS — це різниця між значеннями, вимірюваними на 31 та 0 день. RDS за 0 день коливавлися від 24,7% до 25,9%. Зміна маси — це різниця, поділена на початкову масу (приблизно 42,0 г).

(b) Парне порівняння Тьюкі показало, що лише значення зміни маси були різними для зразків, підкислених піровиноградною кислотою.

Удосконалення пробірок для зберігання зразків покращило анаеробні умови шляхом видалення виділеного газу, тим самим запобігаючи пошкодженню пробки та забезпечуючи герметичне середовище. Результати (рН та RDS) для контрольного зразка були подібними до тих, що спостерігалися в експерименті 1, навіть після продовження терміну зберігання до 31 дня. Незважаючи на те, що RDS трохи знизилися на 0,6%, сік швидко зіпсувався, що продемонстрував рівень рН, який зменшився до 4,5, та утворення цвілі, яке спостерігалося на 10 день зберігання. При початковому рН 5 зразки мали незначні ознаки псування, оскільки рН трохи знижувався до 4,7-4,9. Усі зразки при початковому рН 5 набули темно-коричневого кольору, а цвіль спостерігалася у всіх зразках, крім підкислених масляною кислотою. Хоча в зразках, підкислених масляною кислотою, цвілі не було виявлено, зменшення RDS було найбільшим, порівняно зі зразками, підкисленими оцтовою та піровиноградною кислотами. Результати при рН 5 свідчать про високий рівень активності мікроорганізмів незалежно від використовуваної кислоти. Дані про втрати маси також свідчать про високу мікробну активність при рН 5. Зміна маси забезпечила додаткове просте виявлення погіршення зразка з точки зору мікробного перетворення цукру у вуглекислий газ, що виділяється під час зберігання.

Зразки, підкислені піровиноградною кислотою, при початкових значеннях рН 4,25 та 3,5 показали іншу реакцію, порівняно зі зразками, підкисленими масляною та оцтовою кислотами, при однакових початкових рівнях рН. Значення рН обробок піровиноградною кислотою збільшилися з 4,25 до 4,5 та з 3,5 до 4,3, що вказує на те, що деякі мікроби були активними при рН менше 4,25, ймовірно, метаболізуючи піровиноградну кислоту. Відомо, що піровиноградна кислота є високореактивним проміжним продуктом у метаболізмі клітин, і доля метаболізму піровиноградної кислоти визначається різними факторами, включаючи наявність або відсутність кисню. Наприклад, за наявності кисню піровиноградна кислота може метаболізуватися через цикл Кребса. За відсутності кисню піровиноградна кислота може перетворюватися в інші органічні кислоти або в молочну кислоту та спирти. Як показано на Рис. 1b, рН бурякового соку був дуже чутливим до збільшення молярної концентрації піровиноградної кислоти. І навпаки, невелике поглинання піровиноградної кислоти мікроорганізмами може призвести до відносно значного збільшення рівня рН. Дані RDS та зміни маси також свідчать про те, що висока активність мікроорганізмів спостерігалася в соку, підкисленому піровиноградною кислотою. Найбільша зміна RDS та втрати маси були виявлені для зразків при початковому рН 4,25. Візуальні докази псування (цвіль) також спостерігалися у всіх зразках, підкислених піровиноградною кислотою, навіть, при початковому рН 3,5. Зразки, підкислені оцтовою та масляною кислотами, виявляли незначні ознаки псування або зовсім їх не мали при початкових значеннях рН 4,5 та 3,5. Ці рівні були незмінними, тоді як RDS і маса незначно змінювалися. На відміну від зразків, підкислених піровиноградною кислотою, у зразках, підкислених оцтовою та масляною кислотами, при цих рівнях рН візуальних змін не спостерігалося.

Загалом, зміна маси мала краще співвідношення (r = 0,876, p = 0,001) з RDS, ніж з pH (r = -0,104, p = 0,774). Хоча всі чотири показники (рН, RDS, маса та зовнішній вигляд) були важливими показниками активності мікроорганізмів, сам по собі жоден індикатор не міг надати чіткої картини утримання цукру на всіх рівнях початкового рН. Ці показники використовувалися для простого визначення утримання цукру без використання більш трудомісткого методу високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) для вимірювання загального цукру. Однак результати показників в експериментах 1 і 2 повинні бути підтверджені за допомогою фактичного визначення утримання цукру, щоб з’ясувати, що насправді відбувається з цукром під час зберігання. Тому загальний показник цукру був визначений в експерименті 3.

Експеримент 3

Планування та налаштування експерименту 3 були подібними до експерименту 2, але з невеликими змінами, як показано в Таблиці 1. Однією зі змін в установці було зменшення кисню в кожній пробірці на початку зберігання; отже, об'ємна проба для кожного рівня рН була оброблена азотом, а об’єм кожної пробірки зменшено з 10 до 5 мл. Крім того, усі шість кислот з експерименту 1 були включені в даний експеримент, а вміст цукру вимірювали за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) на початку та в кінці зберігання.

Частини експерименту 3 у Таблиці 5, що повторювали експеримент 2 (у якому використовувалися три кислоти), показали фактично ті самі результати, що й експеримент 2. Зокрема, умови зберігання в експерименті 2, що призвели до стабільного рН, RDS, маси та зовнішнього вигляду, також були стабільними в експерименті 3. Аналогічно, умови зберігання в експерименті 2, які не були стабільними щодо рН, RDS, маси та/або зовнішнього вигляду, також не були стабільними в експерименті 3. Величина зміни нестабільних зразків іноді відрізнялася між двома експериментами, наприклад, зміна RDS при початковому рН 5 для оцтової та масляної кислот. Як правило, величину зміни нестабільних зразків було складно точно відтворити. Відмінності між експериментами 2 та 3 не обов'язково зумовлені зусиллями зменшити початковий рівень кисню або простір у пробірках.

Щоб визначити найефективніші умови зберігання бурякового соку, важливо переглянути дані щодо утримання цукру в Таблиці 5. Утримання цукру — це відношення загального цукру на 38 день зберігання до загального цукру на 0 день для даної кислоти та початкового значення рН. Найефективнішими умовами були масляна, пропіонова та лимонна кислоти при початковому рН £ 4,25 та молочна кислота при рН 3,5; за цих умов утримання цукру становило ~92%. Значення утримання цукру ~92% статистично не відрізнялися від найбільшого утримання цукру 95,6%, що спостерігалося під час використання пропіонової кислоти при рН 3,5. Статистичний аналіз показав, що вміст цукру при початковому рН 3,5 суттєво не відрізнявся від рН 4,25 для масляної, пропіонової та лимонної кислот. У 2013 році вчені повідомили про утримання 99% цукру, коли буряковий сік зберігався з мінеральною кислотою при рН £ 3,5 або рН ³ 9,5 та RDS 64,5% протягом 24 тижнів. Незважаючи на те, що в даному дослідженні буряковий сік зберігався в різних умовах початкового pH, RDS та тривалості зберігання, найкращі органічні кислоти дуже ефективно порівнювалися з мінеральною кислотою.

Деякі умови зберігання в цьому дослідженні були неефективними. Ні оцтова, ні піровиноградна кислота не досягли рівня 88% утримання цукру. Доведення бурякового соку до початкового рН 5 призвело до недостатнього або дуже поганого утримання цукру для всіх кислот. Незважаючи на те, що зразки соку, доведені до рН 5 за допомогою пропіонової та масляної кислоти, не мали помітних змін, утримання цукру становило ~85%. Зразки соку, доведені до рН 5 оцтовою кислотою, мали надзвичайно погане утримання цукру (22%), набагато нижче за контрольний зразок (65%). Можливо, оцтова кислота на цьому низькому рівні діяла як буферний розчин для продовження активності мікроорганізмів та поглинання цукру, тоді як рН контрольного зразка знизився до значно нижчого рівня, що, ймовірно, зупинило подальше поглинання цукру. Хоча піровиноградна та оцтова кислоти були неефективними в умовах даного дослідження, їх ефективність, ймовірно, могла б бути покращена за рахунок збільшення початкової концентрації цукру або подальшого зниження початкового рівня рН, наприклад за рахунок додавання мінеральної кислоти.

Аналіз цукру за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) є трудомістким, але забезпечує прямий доказ утримання цукру, на відміну від змін рН, RDS, маси та зовнішнього вигляду. Тим не менше, для майбутніх досліджень корисно знати, чи можна довіряти простим та швидким показникам, використаним у даному дослідженні, для виявлення різноманітних аспектів умов зберігання. В експерименті 3 утримання цукру показало більше співвідношення зі зміною RDS (r = 0,861, p <0,001), ніж зі зміною маси (r = 0,459, p = 0,048) та pH (r = 0,275, p <0,255). Таким чином, рефрактометрично розчинені тверді речовини (RDS), як правило, є ефективним, простим і швидким показником визначення утримання цукру. Однак при рН ~5 RDS не продемонстрували сильної кореляції з утриманням цукру. За цих умов зміна рН була кращим показником втрати цукру, ніж RDS. Оскільки всі чотири показники, використані в експерименті 3, прості та швидкі, їх можна використовувати для попереднього дослідження умов зберігання.

Таблиця 5. Зміни в підкисленому буряковому соку, що зберігався при 22,5°C протягом 38 днів^(a)

(а) Значення, які означають три повтори. Зміни рН та RDS — це різниця між значеннями, вимірюваними на 38-й та 0-й день зберігання. RDS на 0-й день коливався від 24,8% до 25,4%. Зміна маси — це різниця, поділена на початкову масу (приблизно 47,25 г).

(b) Візуальні зміни включали цвіль, бульбашки та/або помутніння.

(c) Значення, за якими слідує одна і та ж буква, суттєво не відрізняються (p < 0,05).