За матеріалами наукової статті на тему «Інтегративна транскриптоміка виявляє генотипний вплив на придатність цукрових буряків до зберігання» («Integrative transcriptomics reveals genotypic impact on sugar beet storability») міжнародного журналу з молекулярної біології, молекулярної генетики та біохімії «Молекулярна біологія рослин» («Plant Molecular Biology»), серпень 2020 р.

В Європі централізація цукрової галузі викликає тривалу переробну кампанію, в результаті чого тривалість зберігання цукрових буряків може перевищувати 90 днів. Загалом коренеплоди демонструють дуже погану придатність до зберігання через досить активний метаболізм, який використовує цукор у якості джерела енергії. Втрати цукру є особливо невигідними для цукрової галузі. Більше того, гідроліз сахарози призводить до накопичення інвертного цукру (глюкози та фруктози), що є ще одним негативним ефектом для цукрової галузі, в результаті якого зменшується ефективність процесу виробництва цукру.

Було охарактеризовано багато факторів, які впливають на придатність цукрових буряків до зберігання. Одним із найбільш впливових факторів є самі умови зберігання (температура, відносна вологість повітря), але сильні пошкодження, викликані в результаті механічного збирання та обрізання бадилля, також відіграють важливу роль. Пошкодження буряка стимулюють проникнення мікроорганізмів всередину солодкого коренеплоду. Їх колонізація та активність призводять до розвитку кагатних гнилей та цвілей, було виявлено температурно-залежне поширення трьох основних патогенів — сірої гнилі, фузаріозу та пліснявого гриба. Для боротьби з патогенами починається замкнутий цикл ще більшої метаболічної активності коренів буряків, що призводить до вищої метаболізації сахарози рослинами та мікроорганізмами, виділення тепла та подальшого поширення патогенних мікроорганізмів, що супроводжується значними втратами цукру. Що цікаво, деякі дослідження виявили генетичний внесок у придатність буряків до зберігання, при цьому було описано значущі відмінності у втратах цукру між 12 генотипами та зв’язок із початковим вмістом цукру. Подібні результати виявили генотипові відмінності у втратах цукру під час зберігання, які, здавалося, відбувались в основному на основі різного (специфічного для генотипу) мікробного складу. Також відомо, що генотипи, стійкі до патогенів, мають кращу придатність до зберігання, а під час зберігання існує специфічний для генотипу профіль патогену.

У цьому контексті було показано, що підвищена стійкість до патогенних мікроорганізмів має позитивний зв’язок із морфологічними та анатомічними відмінностями, такими як загальна стабільність коренів, специфічний склад клітинної стінки та більший вміст висоложеної стружки (що представляє собою нерозчинні компоненти клітинної стінки). Кількість і склад матеріалу клітинної стінки визначає її міцність та стійкість, слугуючи неспецифічною стійкістю до патогенів. Це підтверджується диференціальною експресією генів після нападу патогенів, які пов’язані з біогенезом клітинної стінки, захистом, стресом та розкладанням. Також було описано вплив генотипу, оскільки генотипи з високими концентраціями висоложеної стружки (нерозчинний матеріал клітинної стінки) перед зберіганням демонстрували менші накопичення інвертного цукру та менше пошкодження патогенами під час зберігання, забезпечуючи кращу придатність до зберігання.

Зрозуміло, що втрат цукру під час зберігання не можна повністю уникнути, а лише зменшити. Однак на більшість супутніх факторів можна впливати, якщо це можливо, тільки обмежено. Незважаючи на те, що, як повідомляється, вплив генотипу на втрати цукру та накопичення інвертного цукру є низьким — 11% та 12% відповідно, передбачається, що цей вплив збільшується зі збільшенням тривалості зберігання. Специфічні для генотипу молекулярні механізми, пов'язані з тривалим періодом зберігання, ще й досі повністю не досліджені. Таким чином, дане дослідження було зосереджено на порівняльній транскриптоміці різних сортів цукрових буряків для виявлення механізмів, які можуть пояснити різний потенціал зберігання. Було охарактеризовано анатомію коренеплодів буряків, цукру та стандартних концентрацій аналіту для виявлення додаткових впливових факторів. Отримані результати спрямовані на забезпечення інформації для покращення програм збільшення стійкості до патогенів та придатності до зберігання. І ті, й інші є складними ознаками, більш важливими для успішного виробництва цукрових буряків, ніж подальше збільшення потенціалу врожайності.

Методи

План дослідження

Схема дослідження зображена на Рис. 1: під час дослідження було використано шість сортів (V1 – V6) цукрових буряків (Beta vulgaris L.), які, як відомо, мають різну придатність до зберігання. Сорти від V1 до V5 були виведені компанією Strube Research GmbH & Co. KG., Німеччина, а V6 — Науково-дослідним та інноваційним центром AGRANA (ARIC), Австрія. Усі шість сортів є стійкими до ризоманії, завдяки чому V1 і V6 мають додаткову стійкість до церкоспорозу, а V1 і V4 є стійкими до нематоди. Усі сорти були вирощені на довільно відібраних ділянках під зрошенням (4 повтори) в Австрії навесні 2017 року та в 2018 році як повтори. 16 жовтня 2017 року цукрові буряки збиралися механічним способом за допомогою самохідного однорядного бурякозбирального комбайна. Гомогенетичні зразки (по 30 буряків у мішку) були сформовані для негайного аналізу цукру та стандартних аналітів (4 повтори) та зберігалися (9 повторів) у постійних умовах (температура між 13 та 5°C, завдяки чому дотримувались температури навколишнього середовища, щоб імітувати більш реалістичні умови зберігання; вологість повітря від 62 до 76%) в камері охолодження.

Сорти були згруповані за трьома класами зберігання на основі їх відносних втрат цукру після 13 тижнів зберігання, виміряних під час зберігання в 2017 році, а саме добре (V1 і V6), нормально (V3 і V4) та погано придатні до зберігання (V2 і V5). Детальніше, придатність до зберігання визначалася відносними втратами цукру (нормованими до середньої втрати маси) під час зберігання. Для цього кожен мішок, що містив 30 буряків, зважувався під час Т0 (до початку зберігання) та у відповідний час відбору проб для розрахунку втрати маси для кожного сорту. Середній вміст цукру (SC) вимірювали, виходячи з наступних доступних копій (мішків): чотири мішки під час збирання врожаю (T0, n = 120), по одному мішку через один тиждень (T1, n = 30), два тижні (T2, n = 30), шість мішків (крім V6, п’ять мішків) через вісім тижнів (T3, n = 180) та один мішок після 13 тижнів зберігання (T4, n = 30). За даними Міжнародної комісії з уніфікації методів аналізу цукру (ICUMSA), вміст цукру (SC) визначали шляхом вимірювання поляризації як °Z (ICUMSA, метод GS 6–3, 1994). Потім розраховували середню втрату цукру на сорт та час відбору проб та нормалізували до загальної середньої втрати маси (3,26%) за відповідний час відбору проб.

Рис. 1. План дослідження. Шість сортів цукрових буряків із різною придатністю до зберігання на основі їх відносних втрат цукру, нормалізованих до середньої втрати маси (у відсотках), вирощувалися на довільно відібраних ділянках, збиралися механічним способом та зберігалися у мішках (30 буряків на мішок) у контрольованих умовах протягом 13 тижнів. Відбір проб проводився через п’ять часових точок (T0 – T4), за допомогою яких досліджували по три буряка кожного сорту. На найтовстішій частині кореня робили поперечний переріз, стерилізували поверхню та витягували чотири куски: для транскриптоміки, метаболоміки, анатомічного аналізу та один у вигляді копії. Решта частин кореня використовували для визначення цукрів та стандартних аналітів.

Відбір проб для подальшого транскриптомічного, метаболомічного та анатомічного аналізів проводили у п’ять часових точок: під час збирання врожаю (16 жовтня, T0), через 1 тиждень (24 жовтня, T1, 91 градусоднів), 2 тижні (31 жовтня, T2, 168 градусоднів), 8 тижнів (12 грудня, T3, 525 градусодні) та 13 тижнів (16 січня 2018 р., T4, із 704 градусоднями, виміряними 12 січня) після збирання врожаю.

Під час кожного відбору з одного мішка виймали по три окремих буряка на сорт як біологічні копії, за винятком Т0 (до початку зберігання), де додатково відбирали 10 коренеплодів. Після зважування та фотографування кожного буряка із середини коренеплоду, де він був найтовстішим, вирізали диск, а поверхню стерилізували 70% етанолом. За допомогою французької бурякорізки вирізану середину коренеплоду розрізали на чотири невеликі прямокутні блоки (1 × 1 × 8 см). Три блоки одразу заморожувалися у рідкому азоті для подальшої транскриптоміки та метаболоміки відповідно, а також для повторного зразка. Четвертий блок поміщали у фіксатор FAA (10 мл 37% формальдегіду, 50 мл 96% етанолу, 5 мл оцтової кислоти, 35 мл води) на один день, включаючи деаерацію 10 хв, після чого послідовно промивали етанолом до 70%, в якому зразок зберігався до подальшої переробки для анатомічного аналізу. Решта частин буряка використовувалися для визначення цукру та стандартних аналітів.

Результати

Вміст та втрати цукру

Беручи до уваги дані мішків, перед зберіганням (Т0) сорт V6 мав найбільший вміст цукру (SC) (16,84%), за яким слідував сорт V3 (16,48%). Решта сортів мали приблизно однаковий вміст цукру, який коливався від 14,14 до 14,71%. Після 13 тижнів зберігання (Т4) V6 та V3 мали найвищий вміст цукру (SC) — 16,84% та 15,36% відповідно, а V2 та V5 — найнижчий (12,41% та 10,70% відповідно).

У даному дослідженні визначення придатності до зберігання базується на специфічних для сорту втратах цукру: V2 та V5 показали найвищий рівень втрат (18,33% та 26,81%) і вважалися погано придатними до зберігання. V3 та V4 розглядалися як нормально придатні до зберігання (середнє зберігання) з коефіцієнтом втрат 9,81% та 9,51% відповідно, у порівнянні з V1 та V6, двома сортами, які утримували відносно незмінний вміст цукру з коефіцієнтом втрат 6,33% та 3,28% відповідно, які, таким чином, були визначені як два добре придатні до зберігання сорти (Рис. 1). Під час зберігання втрати цукру супроводжувалися збільшенням вмісту інвертного цукру для всіх сортів буряків із середнього рівня 1 357 мг/кг під час Т0 в середньому до 3 935 мг/кг під час Т4 (Таблиця S2). Цікаво, що ще до початку зберігання у погано придатних до зберігання сортах був більший вміст інвертного цукру (в середньому 1 292 мг/кг, порівняно з 734 мг/кг у добре придатних до зберігання сортах), ця різниця була ще більше вираженою під час Т4 (5 804 мг/кг, у порівнянні з 2 263 мг/кг). Що стосується вмісту висоложеної стружки, то до початку зберігання сорти, добре придатні до зберігання, мали вищий її вміст, ніж погано придатні до зберігання сорти. Однак під час зберігання було виявлено тенденцію до погіршення придатності до зберігання сортів, які добре зберігалися (в середньому від 5,18% до 4,57%), порівняно з тенденцією до покращення придатності до зберігання сортів, які погано зберігалися (в середньому від 3,74% до 4,40%), тому після 13 тижнів зберігання усі сорти мали приблизно однакову придатність до зберігання.

Беручи до уваги індивідуальні результати вимірювань за всі часові точки, всі шість сортів буряків із трьома біологічними повторами, фруктоза, глюкоза та інвертний цукор виявилися позитивно взаємопов’язаними між собою на основі кореляції Пірсона. Як і очікувалося, поєднання калію та натрію (K + Na) було позитивно пов’язане з обома параметрами — калієм та натрієм. З іншого боку, вміст цукру (°Z) був негативно пов’язаний зі зменшенням порядку натрію, K + Na, фруктози, інвертного цукру та глюкози. Крім того, перед аналізом цукру буряк кожного сорту оцінювали щодо наявності кореневої гнилі. Помітно, що після 13 тижнів зберігання (Т4) добре придатні до зберігання сорти мали більший відсоток здорових буряків (V1: 56,7%, V6: 81,1%), ніж сорти, які погано зберігалися (V2: 23,8%, V5: 4,8%).

Рис. 2. Товщина перидерми. Поперечний переріз буряка (62210) сорту V5, який погано зберігався (a), порівняно з буряком (62216) сорту V6 (b), який добре зберігався, під час T0. Розмір зразка — 500 мкм. Під час зберігання товщина перидерми збільшувалася (с), але розбіжність товщини перидерми між погано та добре придатними до зберігання сортами під час Т0, не була виявлена під час Т4.

Анатомія буряка та кількісне визначення лігніну

Під час зберігання у всіх сортів буряків товщина перидерми збільшилася із середнього значення 26 мкм в середньому до 108 мкм. Що стосується зберігання, особливо під час Т0, погано придатні до зберігання сорти мали більш товсту перидерму. Сорт V5 вже мав добре розвинену перидерму (в середньому 33 мкм), тоді як V6 характеризувався досить тонким епідермісом (в середньому 18 мкм) під час T0 (Рис. 2). Під час зберігання всіх сортів буряків кількість клітин паренхіми мала тенденцію до збільшення в 1,5 рази. До початку зберігання (T0) кількість клітин була в 1,5 рази більшою у добре придатних до зберігання сортів, однак після 13 тижнів зберігання невідповідність між добре та погано придатними до зберігання сортами вже не була такою значною (Рис. 1). На відміну від цього, під час зберігання всіх сортів середня площа клітин паренхіми дещо зменшилася. До початку зберігання площа клітин паренхіми була нижчою у добре придатних до зберігання сортах (у середньому 2 940 мкм²), порівняно з сортами, які погано зберігалися (в середньому 4 429 мкм², Рис. 1). Після 13 тижнів зберігання різниця у площі клітин між добре і погано придатними до зберігання сортами (середня різниця 723 мкм²) була не такою вираженою, як до початку зберігання (середня різниця 2 468 мкм²). Під час зберігання кількість камбіальних кілець не змінювалася, однак було помічено різницю між добре і погано придатними до зберігання сортами, внаслідок чого перші мали, як правило, більше їх число, ніж другі (в однакові часові точки, T0 і T4; Рис. 1).

Під час зберігання вміст лігніну, вимірюваний як відсоток матеріалу клітинної стінки, зменшився із середнього рівня 3,3% під час Т0 до 1,9% під час Т4 (Рис. 1). Існувала тенденція того, що зниження його вмісту було більшим у сортах, які погано зберігалися (в середньому -1,89%), ніж у сортах, які добре зберігалися (в середньому -0,89%). У перші часові точки (T0, T2) вміст лігніну був вищим у погано придатних до зберігання сортах. Під час Т4 вміст лігніну вирівнявся між добре та погано придатними до зберігання сортами.

Фенотипічні фактори, які впливають на придатність до зберігання

Щоб перевірити, які фактори, крім експресії генів, можуть бути корисними для визначення сорту, добре або погано придатного до зберігання, було проведено регресійний аналіз дерева. Було виявлено основні характерні фактори: альфа-аміно азот, інвертний цукор та кількість камбіальних кілець (Рис. 3). Регресія розпадається на дві основні гілки відповідно до альфа-аміно азоту, яка є меншою або дорівнює визначеному відрізку 14 ммоль/кг, щоб відрізнити більшість сортів, які добре та нормально зберігаються, від сортів, які погано зберігаються. Потім ці дві гілки знову розділяються відповідно до вмісту інвертного цукру.  У крайній лівій та центральній гілках нижчий вміст інвертного цукру чітко відокремлює хорошу придатність до зберігання від помірної до поганої придатності. Вміст інвертного цукру менше 781 мг/кг або 881 мг/кг частіше асоціюється з хорошою придатністю до зберігання. У крайній правій гілці з вмістом інвертного цукру щонайменше 1060 мг/кг відбувається додаткове розщеплення відповідно до кількості камбіальних кілець, що чітко відокремлює погане зберігання від хорошого та нормального. Наявність п’яти або менше камбіальних кілець однозначно пов’язано з поганою придатністю до зберігання, тоді як більше ніж п’ять камбіальних кілець свідчать про хороше зберігання зразків із високим вмістом інвертого цукру.

Рис. 3. Регресійний аналіз дерева. Дерево показує найбільш впливові параметри придатності до зберігання (з 11 анатомічних та стандартних аналізованих параметрів аналіту). Графік у вигляді стовпців показує відсотковий розподіл зразків, що належать до кожного з класів зберігання, які потрапляють у вказаний вузол дерева. Число в дужках означає кількість усіх зразків цього вузла. Регресія розділяється на дві основні гілки, одна з яких відділяє хорошу та нормальну придатність до зберігання, тоді як інша в основному містить спостереження помірної та поганої придатності до зберігання. Загалом, відбувається п’ять розподілів, які стосуються найбільш важливих змінних для розділення типів зберігання: альфа-аміно азот, вміст інвертного цукру та кількість камбіальних кілець.

Транскриптоміка

Спільні зміни під час зберігання

Було проведено парний DEG-аналіз (диференційовано експресованих генів) для кожного сорту буряків після 13 тижнів зберігання (T4), порівняно з буряками до початку зберігання (T0), щоб визначити транскрипційні зміни з плином часу. Кількість диференційовано експресованих генів (DEGs) для кожного сорту коливалася від 2 754 до 3 863. Спільні диференційовано експресовані гени (Рис. 4) було писано як лінія перетину DEGs усіх сортів, що призводить до 257 позитивно регульованих та 403 негативно регульованих генів у сортах під час Т4. Візуалізація аналізу генної онтології (GO) для цих генів показала найбільш суттєві зміни під час зберігання, пов’язані з катаболізмом лігніну або метаболізмом фенілпропаноїдів, а також біогенезом клітинної стінки, включаючи конденсацію хромосоми (Рис. 4). Дослідження диференційовано експресованих генів (DEGs) показали сім ксилоглюкан ендотрансглюкозилаз, а також сім негативно регульованих лаказ, що свідчить про те, що під час зберігання цукровий буряк зменшує ріст клітин та структуру/цілісність клітинної стінки. З іншого боку, три конденсуючі гени, необхідні для розщеплення хромосоми, були позитивно регульованими під час Т4. Серед 20 найкращих позитивно регульованих генів було виявлено чотири регулятори, пов’язані з цитокінезом: KEULE, актин-деполімеризуючий фактор, SWR1-комплексний білок 4 та гістондеацетилаза 19, гени, які контролюють цвітіння та світлову реакцію, та два гени, необхідні для стійкості до абіотичних стресів (зеаксантин-епоксидаза, дельта(8) -жирно-кислотна десатураза). Серед перших 20 негативно регульованих генів було виявлено EXORDIUM-подібний 3, ген, який діяв як негативна регуляторна система поділу клітин, а також дві метилтрансферази та фосфатаза, які регулюють експресію генів під час розвитку та два гени, що регулюють життєздатність клітин (SKIP1, синаптоагмін 2).

Таблиця 1. Кількість диференційовано експресованих генів (DEGs) у парному порівнянні з градієнтом кольору від зеленого до жовтого та червоного, що відображає діапазон від 71 до 2 885 DEGs, відповідно.

Рис. 4. Спільні зміни під час зберігання. Діаграма Венна, що показує 660 загальних диференційовано експресованих генів під час зберігання (а). Аналіз генної онтології (GO) цих генів візуалізується за допомогою REVIGO (b).