Вплив екстракційної температури, походження та якості цукрових буряків на перетворення нітритів і нітратів під час вилучення цукрози зі стружки (частина 1)
(За матеріалами журналу «Цукровий бізнес»», №1 (7), лютий 2019 р.).
Нітрити в основному утворюються при скороченні нітратів під час екстракції цукрози з цукрових буряків. Частина цих сполук проходить через весь процес виробництва і накопичується в мелясі. Меляса є цінним матеріалом для виробництва кормів для тваринництва, що лише тимчасово виключаються з переліку продуктів, що підлягають обмеженню щодо вмісту нітритів. Метою даного дослідження було визначити вплив температури, а також якості цукрових буряків та регіону їх вирощування на перетворення нітратів у нітрити під час вилучення цукрози з високоякісних або примерзлих цукрових буряків, вирощених у Польщі та у Швеції. Екстракцію цукрози проводили в лабораторних умовах при 50, 60 і 70 °С. Швидкість скорочення нітратів під час цього процесу була найвищою при найнижчих досліджених температурах, тобто при 50 °C, незалежно від походження та якості цукрових буряків. При 70 °C швидкість зниження вмісту нітратів була нижчою, але процес відбувався. Значний вплив походження цукрових буряків на швидкість перетворення нітратів у нітрити спостерігався особливо при температурах 50 і 70 °С
Вміст нітратів у коренях цукрових буряків залежить в основному від дози азотних добрив і кліматичних умов під час вирощування, а нітрити або відсутні, або присутні у незначних кількостях. Однак, концентрація пізніх іонів може збільшуватися під час технологічної переробки цукрових буряків через зниження вмісту нітратів, яке здійснюється певними бактеріями. Бактеріальне перетворення нітратів у нітрити відбувається в основному на етапі вилучення цукрози зі стружки. Основним джерелом мікробного забруднення під час екстракції цукрози є залишки ґрунту, прикріплені до коренів цукрових буряків і введені разом зі стружкою до екстрактора. З цукрових соків виділяються численні бактеріальні види (аеробні, факультативні аеробні та анаеробні), здатні до перетворення нітратів у нітрити.
Денітрифікація, що відбувається під час екстракції цукрози, може бути повною і продукувати молекулярний азот з проміжних нітритних іонів, отриманих шляхом перетворення нітратів. Повна денітрифікація, що дає оксиди азоту та молекулярний азот, керується багатьма видами: Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus та Spirilum. Мікробні види проводять також часткову денітрифікацію, тобто перетворення нітратів у нітрити.
Денітрифікація, яку проводять різноманітні бактерії в аноксичних умовах, включає серію реакцій від нітратів (NO3 - -N) до газоподібного азоту (N2). Цей процес каталізується нітрат-редуктазою (Nar), нітрит-редуктазою (Nir), редуктазою оксиду азоту (Nor) і редуктазою закису азоту (Nos). Концентрація нітритів у сировинному соку 0,001-0,002% розглядається як показник високого рівня бактеріального забруднення. Концентрація нітритів при екстракції цукрози змінюється у широкому діапазоні 5-70 мг/л. Зазвичай бактеріальне продукування нітритів починається до виробництва молочної кислоти і тому численні автори пропонують оцінити мікробне забруднення всередині екстрактора на основі концентрації нітритів. Проте, інтенсивність утворення цих іонів змінюється з профілем бактеріальної мікрофлори, і, як було зазначено вище, багато бактерій перетворюють нітрити в оксид азоту та молекулярний азот. Таким чином, відсутність нітритів у соку не свідчить про хороший мікробіологічний стан вилученого соку.
Нітрати і нітрити не адсорбуються карбонатом кальцію під час очищення. Тому вони проходять процес очищення і переходять на наступні етапи технологічного процесу. На цукровому заводі невелика кількість нітратів і нітритів може знаходитись у кристалі цукрози. Частина нітритів може реагувати з іншими сполуками, що призводить до зниження їх вмісту у напівфабрикатах на кінцевих стадіях виробничого процесу. Решта нітритів і нітратів накопичуються у мелясі. Меляса та буряковий жом є цінними матеріалами для виробництва кормів для тваринництва, які лише тимчасово виключені з переліку продуктів, що підлягають обмеженню вмісту нітритів. Підвищена кількість нітритів у мелясі та буряковому жомі знижує якість кормових матеріалів, оскільки надлишок цих сполук у раціоні тварин негативно впливає на їхнє здоров'я. Крім того, іони нітритів можуть вступати в реакцію з діоксидом сірки з утворенням імідодисульфонової кислоти, яка, взаємодіючи з калієм, виробляє малорозчинну сіль – імідодисульфонат калію. Цей продукт може бути усунений при першій карбонізації, переходячи в карбонізацію вапна, якщо сировинний сік зазнає сульфітацію. Однак, якщо сульфітація застосовується тільки на більш пізній стадії – до рідкого або густого соку, після перевищення певного рівня концентрації, імідодисульфонат калію співкристалізується з білим цукром, істотно підвищуючи зольність. Якщо діоксид сірки використовується у реакціях з нітритами, то його концентрація зменшується і є недостатньою для оптимального утворення забарвлених сполук. Навіть невеликі кількості нітритів, що утворюються у результаті термофільної бактеріальної активності, можуть призвести до значного зниження ефективності сульфітації і значного підвищення кольоровості цукрових соків. Метою даного дослідження було визначити вплив температури екстракції цукрози, а також якості цукрових буряків на концентрацію нітритів і нітратів під час процесу екстракції.
Матеріали та методи
Матеріали
Характеристики цукрових буряків, вирощених у Польщі або Швеції, які використовувалися у цьому дослідженні, представлені у Таблицях 1 і 2. Примерзлі цукрові буряки були отримані в лабораторних умовах із цукрових буряків високої якості, які інкубували (зберігали) при -20 °С протягом 5 днів, а потім інкубували протягом 3 днів при +20 °С.
Таблиця 1. Хімічний склад цукрових буряків з Польщі
| Цукрові буряки | Високої якості | Примерзлі |
| Сухі речовини (СР), % | 26.10 ± 1.55 | 27.44 ± 1.79 |
| Цукроза, % | 17.25 ± 0.52 | 16.92 ± 1.03 |
| Глюкоза, мг/100 г СР | 0.20 ± 0.03 | 1.53 ± 0.06 |
| Фруктоза, мг/100 г СР | 0.08 ± 0.01 | 1.65 ± 0.11 |
| Нітрати, мг/100 г буряка | 14.5 ± 1.1 | 17.7 ± 1.6 |
| Нітрити, мг/100 г буряка | НВ | НВ |
| Молочна кислота, мг/100 г СР | 62.3 ± 1.5 | 267.4 ± 5.6 |
| Оцтова кислота, мг/100 г СР | 49.5 ± 5.3 | 387.3 ± 7.8 |
НВ – Нижче рівня виявлення (нижче 0.015 мг/л)
Таблиця 2. Хімічний склад цукрових буряків зі Швеції
| Цукрові буряки | Високої якості | Примерзлі |
| Сухі речовини (СР), % | 26.79 ± 2.05 | 28.33 ± 2.09 |
| Цукроза, % | 16.89 ± 0.67 | 16.68 ± 0.89 |
| Глюкоза, мг/100 г СР | 0.18 ± 0.02 | 1.87 ± 0.07 |
| Фруктоза, мг/100 г СР | 0.14 ± 0.01 | 1.55 ± 0.09 |
| Нітрати, мг/100 г буряка | 12.7 ± 1.8 | 16.1 ± 2.0 |
| Нітрити, мг/100 г буряка | НВ | НВ |
| Молочна кислота, мг/100 г СР | 40.7 ± 3.0 | 467.6 ± 3.8 |
| Оцтова кислота, мг/100 г СР | 34.3 ± 2.1 | 443.2 ± 4.4 |
НВ – Нижче рівня виявлення (нижче 0.015 мг/л)
Підготовка цукрових буряків до екстракції
Цукрові буряки були нарізані за допомогою спеціального лабораторного різака для виготовлення поперечної стружки. Для тестів було вибрано стружку подібної довжини. Повторні порції стружки (80 г) затримувались у стерильній дистильованій воді (400 мл, температурою 25 ± 2 °С) і були доповнені дозою розчину нітрату при 25 °С (приготований з використанням дистильованої води і нітрату калію), для того щоб спостерігати процес перетворення нітратів у нітрити протягом 6 год інкубації при 50, 60 і 70 °C на струшувальній водяній бані при зниженій доступності кисню. Було використано 300 мг/л кінцевої концентрації нітрату калію. Температура води у водяній бані була на 5 °C вище температури всередині екстракційних сумішей (55, 65 і 75 °C, відповідно).
Зразки соку брали кожні 20-30 хв для кількісного визначення нітратів і нітритів іонообмінною хроматографією. Дані зразки розводили дистильованою водою (18 МОм) у співвідношенні 1:5 і фільтрували через мембранні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм. Зміни рН екстракційного соку контролювали кожні 30 хв.
Експеримент проводили у двох паралельних повторах. Аналіз вмісту нітратів і нітритів у даному зразку соку проводили у двох варіантах.
Кількісна оцінка нітратів і нітритів
Хроматографічний аналіз проводили з використанням хроматографа DIONEX ICS-3000 (Dionex, США), обладнаного детектором провідності CD-PED від DIONEX (США) і супресором провідності ASRS-ULTRA II 4 мм (Dionex, США). Іони нітритів і нітратів були розділені за допомогою аналітичної колонки Ion Pac AS11-HC (4 x 250 мм) і захисної колонки Ion Pac AS11-HC (4 × 50 мм). Іони відокремлювали при швидкості потоку 1,5 мл хв-1, температурі колонки 35 °С і об'ємі впорскування 25 мкл, використовуючи градієнт 100 мМ NaOH – елюент А (50% v/v у воді NaOH, Sigma-Aldrich®, Europe) і дистильованої води 18 МОм – елюент B, згідно з наступною програмою часу і композиції (співвідношення елюентів A і B були виражені у % [v/v]): від -1 до 0 хв – 5 і 95; від 0 до 10 хв – 5 і 95; від 10 до 15 хв – 15 і 85; від 15 до 25 хв – 30 і 70; від 25 до 34 хв – 60 і 40; від 34 до 37 хв – 5 і 95. Результати хроматографічного аналізу реєстрували, використовуючи програму Chromeleon®, версія 6.80.
Визначення значення рН екстракційного соку
РН екстракційного соку вимірювали за допомогою рН-метра (Cp-502, Elmetron). Вимірювання проводили при експериментальній температурі.
Обговорення результатів
Концентрація нітратів поступово зменшувалася в екстракційному соку у всіх варіантах процесу екстракції.
Концентрація нітритів поступово збільшувалася у початковий період екстракції, а потім поступово зменшувалася після досягнення певного значення. Це говорить про те, що нітрити утворювалися і далі перетворювалися під час екстракції цукрози.
Процес вилучення цукрози зі стружки цукрових буряків проводився протягом відносно тривалого часу для моніторингу зміни концентрацій нітратів і нітритів. Згідно з Валеріанчиком (1996), середній час перебування стружки в жолобному екстракторі залежить від параметрів процесу і коливається від 60 до 100 хвилин. В опорних екстракторах стружка обробляється протягом 90-105 хвилин. Однак, окремі шматочки стружки можуть залишатися в екстракторі протягом 60-180 хвилин.
Концентрація нітратів поступово зменшувалася протягом перших трьох годин вилучення цукрози зі стружки для майже всіх варіантів умов екстракції. Тільки при екстракції цукрози з високої якості польських цукрових буряків, проведених при температурі 70 °С, концентрація нітратів в екстракційному соку почала зменшуватися після перших чотирьох годин (Графік 1). За цей період часу, що відповідає постійній концентрації нітратів, рівень нітритів підтримувався нижче рівня виявлення, тобто 0,015 мг/л.
Значне зниження вмісту нітратів в екстракційному соку спостерігалося під час вилучення цукрози при 60 і 50 °С (Графік 1). Після перших трьох годин екстракції при 60 °С концентрація нітратів була на 48% нижчою (вона зменшилася з 300 мг/ до 157 мг/л). Коли екстракцію проводили при 50 °С, вміст нітратів знизився до 106 мг/л (65% від початкової концентрації).
Після перших трьох годин вилучення цукрози зі стружки, отриманої з цукрових буряків високої якості зі Швеції, концентрація нітратів була значно знижена, незалежно від температури вилучення (Графік 2). Вона знизилася на 44%, з 300 мг/л до 169 мг/л, коли екстракцію проводили при 70 °С, а на 50% (до 151 мг/л) і 81% (до 58 мг/л), коли процес відбувався при 60 і 
50 °С, відповідно.
Було відмічено, що зниження вмісту нітратів в екстракційному соку залежало від виду бурякової стружки й умов екстракції. У більшості випадків воно залежало від температури вилучення. Це було особливо помітним у випадку польських цукрових буряків як високої якості, так і примерзлих, що представлено на Графіках 1 і 3. Підвищення температури вилучення на 10 °C, тобто від 60 до 70 °C, спричинило зниження вмісту нітратів в екстракційному соку з високої якості польських цукрових буряків, що розпочалося близько двох з половиною годин пізніше (Графік 1). У випадку вилучення соку з примерзлих польських цукрових буряків початок зниження вмісту нітратів було відкладено на 100 хвилин, коли температура вилучення була збільшена на 20 °C (від 50 до 70 °C) (Графік 3). Таким чином, екстракція при температурі 70 °С викликала затримку початку зниження вмісту нітратів. Проте, настільки сильний вплив температури вилучення на початок зниження вмісту нітратів не спостерігався у випадку високої якості та примерзлих шведських цукрових буряків (Графіки 2 і 4).
Вплив температури на швидкість зниження вмісту нітратів під час екстракції цукрози у лабораторних умовах був особливо сильним у випадку польського цукрового буряка високої якості або примерзлого (Графіки 1 і 3). Для цих стружок швидкість зниження вмісту нітратів зменшувалася з підвищенням температури від 50 до 70 °С.
Для шведських цукрових буряків вплив температури вилучення на швидкість зниження вмісту нітратів був слабшим. Ця швидкість була найвищою при 50 °C (Графіки 2 і 4), як у випадку польських цукрових буряків, а при 60 і 70 °C процес був повільнішим, однак, зростання швидкості перетворення нітратів при збільшенні температури з 60 до 70 °С було відносно невелике (Графік 4).
Цікаво, що швидкість зниження вмісту нітратів під час екстракції цукрози у лабораторних умовах була найвищою при найнижчій температурі вилучення – 50 °C, незалежно від походження та якості цукрових буряків. Дослідження Де Бруїна (1991) показали, що зниження вмісту нітратів у сирому соку почалося після 4-годинної інкубації при 45 °С, і протягом перших 4 годин концентрація цих іонів підтримувалася при 300 мг/л. Протягом цього періоду часу сік не містив нітритів. Проте, всі нітрати були знижені протягом наступних 2 годин (їх концентрація знизилася до 0). У нашому дослідженні повне зниження вмісту нітратів відбувалося під час екстракції цукрози з високої якості шведських цукрових буряків. Його спостерігали через 6 годин при 60 °С і через 5 годин при 50 °С (Графік 2).
Нітрати відновлюються шляхом денітрифікуючих бактерій, як Gram (+) і Gram (-), зокрема, що належать або відносяться до роду Bacillus, таких як штами Bacillus stearothermophilus (тепер Geobacillus stearothermophilus), Bacillus licheniformis, Bacillus azotoformans, Bacillus halodenitrificans (зараз Virgibacillus halodenitrificans), Bacillus firmus. Денітрифікація також була продемонстрована у членів роду Streptomyces.