За матеріалами наукової статті на тему «Ризоманія — огляд» («Rhizomania - A Review») міжнародного журналу сучасної мікробіології та прикладних наук, №6, листопад 2017 р.

Генетична стійкість до BNYVV вперше була виявлена компанією Holly Sugar в 1983 році. Домінантний ген отримав назву «ген Holly» або Rz1, але він надає лише часткову стійкість. Широке використання сорту цукрових буряків, що демонструє часткову стійкість, хоча й підтримує вихід цукру, з іншого боку, дозволяє посилити вірус-інфікований вектор і, таким чином, викликати появу ізолятів, що руйнують стійкість. Щоб протистояти цьому ризику, в США насіннєва компанія SESVanderHave вивела стійкі до ризоманії сорти, засновані на технології «Tandem Technology®». Гібрид цукрового буряка має стійкість, що поєднує «ген Holly» з іншим джерелом стійкості від Beta maritima. Крім того, штучно виділена стійкість представляє альтернативу природній стійкості та забезпечує більш високі рівні захисту, ніж Rz1.

Ризоманія вважається одним із найбільш шкодочинних хвороб цукрових буряків у всьому світі. Ця хвороба в першу чергу вражає корінь рослини починаючи зі стадії розвитку рослинного покрову в червні. Термін «ризоманія» з грецької означає «кореневе божевілля», який був обраний в 1966 році через один із найхарактерніших симптомів хвороби: проліферація бічних корінців уздовж головного кореня.  Хоча ризоманія була вперше описана в Італії в1959 році, але про збудника хвороби ніхто не знав до 1973 року, коли двоє японських фітопатологів Тамада і Баба довели, що збудником ризоманії є фітовірус — так званий вірус некротичного пожовтіння жилок буряків (BNYVV).

BNYVV належить до роду Benyvirus, збудником хвороби є ґрунтовий гриб Polymyxa betae, представник класу плазмодіофороміцети. Гриб — облігатний внутрішньоклітинний паразит, обмежений коренями Лободових, утворює спори (цистосорус), які є стійкою стадією, що підтримує вірус у ґрунті протягом багатьох років.

Організація геному BNYVV складається з декількох геномних одноланцюгових смислових РНК. РНК 1 і 2 кодують конститутивні гени, що забезпечує ауторепродукцію та клітинну транслокацію, тоді як РНК 3, 4 та 5 необхідні для переносника інфекції та розвитку хвороби в коренях цукрових буряків.

Ця хвороба передусім вражає головний корінь рослини, що призводить до наднормової проліферації бічних корінців уздовж кореня, утворення некротичних кілець у кореневій частині та хлоротичного листя.

Із виробничої точки зору, хвороба скорочує врожайність на 45-50% або більше, а вміст цукру — на 60-79%. Ризоманія призводить до значного погіршення врожайності та якості коренеплодів, де б вона не виникала. На щастя, була виявлена сильна генетична стійкість до BNYVV, надана геном Rz1.

Географічне поширення ризоманії

Ризоманія вперше була виявлена в 1950-х роках в Італії на рівнині річки По та в долині річки Адідже. Із 1971 по 1982 рік спостерігалося поширення цієї хвороби в країнах Центральної та Південної Європи: Австрії, Франції, Німеччині, Греції, Югославії.

Через 60 років після відкриття вірусу в Італії, ризоманія широко поширилася в багатьох країнах Європи, а також була виявлена в інших районах-виробниках цукрових буряків, включаючи США, країни СНД, Китай та Японію.

Симптоми хвороби

Синдром ризоманії з грецької означає «кореневе божевілля» (Rhizo: корінь; Mania: божевілля). На інфікованих цукрових буряках у тій чи іншій мірі проявляється недорозвиток головного кореня, в результаті якого зменшується його розмір, що загрожує некрозом. Інфекція викликає недорозвиток головного кореня та проліферацію бічних корінців, які стають некротичними, незліченними та ламкими. Ці симптоми зменшують поглинання вологи з ґрунту, що викликає в’янення листя. Іноді, коли інфекція стає системною, виникає пожовтіння жилок, некроз та опосередковане ураження листя. Пожовтіння листя з подальшим некрозом жилок, виявлене в Японії, дало назву дуже характерному, але рідкісному вірусу. Хаясака та ін. (1988) припускали, що хлороз може бути наслідком дефіциту мінеральних речовин, спричиненого пригніченням поглинання живильних речовин коренем, сильно пошкодженим вірусною інфекцією. Інфіковані корені мають високий вміст редукуючих цукрів, K і Na, а також менший вміст загального N, NH₂ – N, NH₄ – N та бетаїну, порівняно зі «здоровими» рослинами. Однак BYNVV також може викликати розвиток прихованих інфекцій без видимих симптомів. Особливо це стосується прохолодних умов навесні.

Збудник хвороби — вірус некротичного пожовтіння жилок буряків (BNYVV)

BNYVV має багатороздільний лінійний одноланцюговий смисловий геном, який складається з чотирьох-п'яти РНК, які виробляють 5'-кеп та поліаденілуваний 3'-кінець. BNYVV відноситься до надгрупи головних вірусоподібних і є типовим видом роду Benyvirus. Паличкоподібний вірус має спіральну симетрію. Його діаметр становить приблизно 20 нм, довжина пропорційна розмірам інкапсульованих РНК, тобто 390, 265, 105, 89 і 80 нм.

РНК-1 і -2 є необхідними і достатніми для інфікування після механічних інокуляцій листя, де дрібні компоненти не є обов’язковими і, якщо вони є, можуть видалятися або зникати. Однак ці невеликі компоненти є необхідними у випадку природного інфікування. Дійсно, РНК-3 дозволяє посилити розвиток вірусу в коренях цукрових буряків і її прояв викликає симптоми, тоді як РНК-4 бере участь у трансмісії вірусу. Більше того, РНК-4, що кодує Р31, описується як кореневий ген-супресор. Таким чином, BNYVV — це унікальний вірус, оскільки він поводиться як двороздільний вірус, коли виникає проблема, або як трироздільний або п’ятироздільний вірус у випадку природного інфікування.

Було ідентифіковано три штами вірусу (тип A, B і P) відповідно до їх структури РНК. Тип А є найпоширенішим і виявленим у більшості країн Європи, а також у Північній Америці, Японії та Китаї. Тип B також поширений у Франції, Німеччині та Великобританії.

Як правило, вважається, що тип P є більш агресивним та має додаткову РНК-5. Він був виявлений в основному поблизу французького муніципалітету Пітів’є та в Казахстані. У даний час тип P досить активно обговорюється, оскільки, здається, що він є переносником найбільшої концентрації вірусу.

Цикл хвороби

Ґрунтовий гриб Polymyxa betae є переносником BNYVV до здорових коренів. Асоціація BNYVV з грибом —незвичайний біологічний зв’язок, який призводить до розвитку ризоманії, коли присутній сприйнятливий господар та умови, сприятливі для зараження P. Betae, є всюдисущими. Його розповсюдження охоплює всі райони вирощування цукрового буряка. P. betae належить до плазмодіофорових, монофілетичної групи, що включає десять видів. Тривалий час входив до числа нижчих грибів, зараз його класифікують як одноклітинний організм.

Біологічний цикл ризоманії залежить від життєвого циклу переносника хвороби. Хороша здатність цього переносника до виживання пояснює, по-перше, повторне виникнення вірусних захворювань на заражених полях, по-друге, їх розповсюдження або через ґрунт, що прилипає до сільськогосподарської техніки та зібраного врожаю, або через дренажну та зрошувальну воду. Протягом свого життєвого циклу гриб утворює два види спор, нерухомі спори та рухомі зооспори. Скупчення крихітних товстостінних нерухомих спор, які також називаються цистосорусом, дозволяють грибу жити в ґрунті протягом 15 років або довше за відсутності відповідного господаря. Вірус також може зберігатися у цих нерухомих спорах як мінімум 15 років. Коли ґрунтові умови стають сприятливими для інфікування, проростання нерухомих спор викликається наявністю кореня рослини-господаря. У міру проростання нерухомих спор виділяються рухомі зооспори, які активно надходять до поверхні кореня, де розвиваються нові інфекції. Спочатку проростання спор вивільняє двожгутикові зооспори мінімальним розміром 4-5 мкм, які переміщуються через ґрунтову воду перед потраплянням на кореневий волосок або епідермальну клітину кореня рослини-господаря. Для проникнення в клітину в цистовій зооспорі утворюється діагоналевидна структура, що називається жало «Stachel», а між цистою та клітинною стінкою рослини утворюється липка трубка. Stachel, який вводиться в клітину-хазяїна через трубку, пронизує клітинну стінку і плазматичну мембрану і дозволяє переносити вміст зооспори в цитоплазму клітини-господаря. Зараження коренів зооспорами призводить до утворення тіла гриба, або плазмодію, всередині кореня рослини.

У спорангієвій фазі цей плазмодій перетворюється на багатодольовий зооспорангій, обмежений тонкою стінкою, всередині якої утворюються вторинні зооспори. Вони вивільняються за межами кореня, а іноді і в глибші кореневі клітини невеликими плазмодіальними клітинами, які руйнують клітинні стінки, утворюючи в них отвори. У спороутворюючій фазі спостерігається утворення каріокінезу з формуванням синаптонемальних комплексів, характерних для мейозу. Плазмодій ділиться на одноядерні клітини, утворюючи мембранні шари всередині цитоплазми. Потім між клітинами утворюється чотири-п’ятишарова стінка, а сусідні спори залишаються з'єднаними зв’язками між двома зовнішніми багатослойними шарами. Утворені спори залишаються в кореневих залишках і потрапляють в ґрунт при їх розкладанні. У межах цього життєвого циклу моменти злиття клітин та каріогамії ще не були чітко визначені. Виявлення подвійних чотирьох джгутикових зооспор дозволяє припустити злиття двох зооспор, але значення нуклеосинтезу не відоме. Обидва утворені таким чином види спор стають носіями вірусу BNYVV.

Передача вірусу плазмодіофоридами протягом багатьох років розглядалася як пасивний механізм, який відбувся під час змішування цитоплазми рослинної клітини та найпростіших організмів перед формуванням мембрани. Однак останні дослідження показали особливу роль деяких вірусних білків у процесі передачі вірусу переносником. Домен наскрізного зчитування капсидного білка BNYVV (RT) відіграє важливу роль у процесі передачі, оскільки делеції в С-кінцевій частині цього домену пов’язані з втратою передачі вірусу. Заміна чотирьох амінокислот KTER, розташованих у положенні 553 до 556 домену RT, мотивом ATAR повністю блокує передачу вірусу. Порівняльний аналіз вірусних геномів, які передаються плазмодіофоридами та не мають однакової геномної організації, виявив наявність двох комплементарних трансмембранних доменів у доменах RT капсидного білка Beny-, Furo-, Pomovirus та Bymovirus у білках P2. Делеція або заміщення другого домену також блокує передачу вірусу переносником. Молекулярна модель ще не деталізована, але трансмембранні спіральні послідовності, можливо, можуть визначати конкретну структуру, полегшуючи інвагінацію мембрани та рух вірусу через мембрану переносника.

Фактори поширення та розвитку хвороби

Основним способами поширення хвороби є корені заражених рослин, інфіковані стебла цукрового буряка (можливо, завезені селекціонерами) та ґрунт, що містить P. betae, який є переносником BNYVV. На місцевому рівні відходи цукрових буряків, промивна вода та сільськогосподарська техніка виявилися основними переносниками хвороби. Стійловий гній також може відігравати певну роль у поширенні BNYVV, оскільки P. betae здатний проходити неушкодженим крізь шлунково кишковий тракт тварин.

Факторами навколишнього середовища, які сприяють розвитку хвороби, є ті, що стимулюють розвиток її переносника в ґрунті. Зазвичай для проліферації та кореневої інфекції Polymyxa betae необхідні три важливі умови, такі як наявність рослини-господаря, надлишкова волога в ґрунті для сприяння проростання та полегшення доступу зооспори до кореня, а також досить висока температура між 10 і 30°С, в ідеалі від 20 до 25°С відповідно до походження штамів. PH ґрунту та вміст кальцію також впливають на активність переносника вірусу. На проростання спор та інфікування коренів зооспорами впливають кислотні умови ґрунту (pH). Хвороба переважає в нейтральних або лужних ґрунтах, особливо якщо рівні кальцію та магнію перевищують 350 та 20 мг/100 г ґрунту відповідно.

Діагностика ризоманії

Оскільки прояв симптомів сильно мінливий, діагностика ризоманії не може базуватися лише на візуальному обстеженні рослин. Натомість точний діагноз ставиться за допомогою серологічного імуноферментного аналізу або ферментного імуносорбентного аналізу (ЕЛІЗА). Щодо цукрового буряка, найефективнішим і найпростішим методом виявлення ризоманії є імуноферментний аналіз ЕЛІЗА, проведений на сирому (дифузійному) соку, вилученому з бічних корінців або з кінчика головного кореня. Для максимальної ефективності точного аналізу, зразки цукрових буряків, зібрані для дослідження, повинні включати ново розгалужені відразу після дощу або зрошення корені та надходити в лабораторію протягом одного дня після їх відбору. Поріг чутливості становить 2-6 нг вірусу на г тканини. Отримані таким чином результати є більш достовірними, ніж результати, отримані при інфікуванні рослин-індикаторів (Chenopodiumquinoa).

Також необхідний біологічний тест ґрунту чи налиплої на коренеплід землі. Проводиться аналіз ЕЛІЗА коренів цукрових буряків, вирощених у підозрілому ґрунті. Рослини-приманки, вирощувані перед посівною цукрових буряків, можуть використовуватися для виявлення BNYVV у ґрунті, визначення рівня зараженості, а також для обчислення потенційних втрат врожаю. Однак ці аналізи недостатньо надійні для виявлення дуже низького рівня зараженості, тому не можуть точно довести, що те чи інше поле є вільним від вірусу.

Стратегії контролю

Постійна посівна або сівозміна з короткою ротацією цукрових буряків збільшує ризик втрат через розвиток ризоманії. Рання посівна, коли температура ґрунту не висока, та використання виробничих прийомів, що стимулюють розвиток рослинного покриву, зменшують ризики втрат. Рання посівна повинна виконуватися при трохи більшій щільності посадки рослин, щоб компенсувати більші втрати сходів у прохолоднішому ґрунті. Дослідники пропонують аналіз ґрунту для визначення ризику ризоманії, як допоміжний засіб для вибору відповідного сорту для посівної.  Рекомендується розширення сівозміни, але це матиме обмежений вплив на інфекційний потенціал ґрунту, так як Polymyxa betae/BNYVV може жити в ґрунті протягом не одного десятка років.

Методи хімічної боротьби з переносником хвороби є занадто дорогими (дезінфекція ґрунту бромистим метилом) або малоефективними. Однак деякі ґрунтові фуміганти, такі як Telone II, можуть вбити достатньо цистосорусу, щоб зменшити розвиток хвороби до прийнятних рівнів. Однак використання фумігантів дуже дороговартісне, через що проводяться дослідження для визначення їх ефективності та умов, у яких їх слід використовувати.

Виведення стійких до ризоманії сортів є найефективнішою стратегією боротьби з цією хворобою. Виведення та використання нових сортів, стійких до ризоманії, є першочерговим завданням селекції через широке поширення хвороби у багатьох районах-виробниках цукрових буряках.

Пошук резистентних або стійких сортів активно ведеться з 1978 року, отримані результати були дуже обнадійливими. Перша селекційна програма щодо стійкості до ризоманії стартувала в Італії в 1970 році. Відкриття першого полігенного стійкого джерела, визначеного як «тип Альба», спочатку було отримано із предка цукрового буряка Beta maritima, що належить до ідіоплазми Munerati. Стійкий сорт цукрових буряків «Різор», виведений у 1985 році селекціонером Де Біаджі, став першим сортом, що показав оптимальний рівень стійкості на заражених ризоманією полях. Пізніше джерело «Холлі» було виділено за допомогою селекційних програм USDA у м. Салінас (Каліфорнія, США) спільно з Holly Sugar Company. Ці джерела стійкості мають гарну спадковість, а для покращення ознаки достатньо декількох циклів відбору. Такі сорти буряків, як «Різор» та «Холлі» мають моногенну стійкість.

«Різор»/«Холлі», як і раніше, є найбільш широко використовуваними сортами, стійкими до ризоманії, а на комерційному рівні локус зазвичай називається Rz1. Інший ген моногенної стійкості був ідентифікований в USDA в м. Салінас (Каліфорнія, США) у популяції дикого буряка (WB42), що походить з Данії, та отримав назву Rz2. Нещодавно було виявлено, що титри вірусу BNYVV на цукрових буряках, посіяних в однаковий ґрунт, були більшими для цукрових буряків Rz1, по відношенню до Rz2. Інші молекулярні дослідження, виявили інший ген резистентності (Rz3) на картографічній популяції, отриманий за допомогою схрещування зразка WB41, отриманого з популяції В. maritima в Данії, з чутливою лінією з ідіоплазми Syngenta. У 2007 році було виявлено основний локус кількісних ознак (QTL) для стійкості до ризоманії у розщеплюючій популяції під назвою R36. Цю картографічну популяцію було отримано з C50, складного схрещування зразків B. maritima з цукровим буряком. QTL, що забезпечує стійкість, отримав назву Rz4. Тим не менш, необхідні подальші дослідження для уточнення, чи є Rz4 новим геном стійкості або новим алельним геном.

Розробка та використання стійких до ризоманії сортів дозволили виробникам цукрових буряків значно зменшити шкоду, яку заподіювала ризоманія більше 20 років. Широке використання сорту цукрових буряків із частковою стійкістю, хоча й обмежує вихід цукру, з іншого боку, підтримує поширення переносника захворювання і, отже, виникнення ізолятів, що руйнують стійкість. Нещодавні дослідження показали появу нових штамів BNYVV з підвищеною вірулентністю, які можуть подолати стійкість Rz1. У перспективі, використання сортів, що мають лише один ген стійкості до ризоманії, може бути недостатньо для ефективної боротьби з хворобою. Для зменшення цього ризику, в США компанія SESVanderHave вивела стійкі до ризоманії сорти, засновані на технології «Tandem Technology®». Гібрид володіє стійкістю, що поєднує ген «Холлі» та інше джерело стійкості від Beta maritima. «Tandem technology» показує чудові результати, навіть, при екстремальному тиску ризоманії.

Крім того, штучно виділена стійкість являє собою альтернативу природній стійкості. Отримані трансгенні експресії вірусних послідовностей утворюють дволанцюжкову РНК (dsRNA) і викликають стійкість до BNYVV. Експресія dsRNA викликає придушення експресії РНК, вродженого механізму захисту від інвазивних нуклеїнових кислот, що призводить до специфічного розпаду РНК. Високі рівні стійкості до ризоманії були отримані в цукрових буряках, виражаючи 0,4 т.н. конструкції інвертованого повтору на основі часткової послідовності гена реплікації BNYVV.