* Інгібітори полігідроксинафталіну редуктази в біосинтезі меланіну.

Фактичний ризик залежить не тільки від наявного ризику, але й від умов використання пестицидів. Важливо, щоб якомога більше організмів цільової популяції отримали смертельну дозу препарату. Тому необхідною умовою є хороша обширність дії пестициду. Ризики можна легко зменшити за допомогою альтернативних або комбінованих застосувань пестицидів з різними механізмами. Доза внесення є одним із найважливіших питань у визначенні агрономічного ризику. Зі збільшенням дози ризик фунгіцидної стійкості збільшується чи зменшується? Ван ден Бош та його колеги (2011) під час фази відбору стійких грибкових організмів з’ясували, що зі збільшенням дози внесення фунгіциду збільшується ризик розвитку стійкості. Головним чином, причиною цього є те, що ступінь боротьби з захворюванням можна вважати пропорційним до тиску відбору, що забезпечує виникнення стійких мутантів та моногенної стійкості. Фрагментація оброблюваної ділянки з точки зору рівномірності внесення пестицидів може використовуватися для запобігання відбору та збільшення кількості стійких особин у популяції. Те саме стосується використання заходів, що стосуються комплексної стратегії боротьби зі шкідниками, таких як використання нехімічних методів (стійкі до хвороб сорти, гібриди, сівозміна або санітарно-гігієнічна практика), що знижують тиск хвороби. Вторинні чутливі цільові організми також повинні враховуватися, коли виникає тиск відбору, хоча вони знаходяться нижче епідемічного порогу для початку лікування. Це додатково збільшує ризик розвитку стійкості. Необхідно відмітити, що обробка різних сільськогосподарських культур на одній ділянці одним і тим же пестицидом збільшує ризик розвитку стійкості, тоді як здійснення обробки з певним часовим проміжком зменшує ризик.

Таблиця 3. Фактори оцінки агрономічного ризику

Стійкість Cercospora beticola до фунгіцидів MBC-, QoI- та DMI, молекулярна основа та практичні наслідки

Cercospora beticoIa вважається найпоширенішим збудником хвороб листя цукрових буряків у всьому світі. За сприятливих кліматичних умов та неефективного контролю епідемії може викликати значне скорочення виходу цукру та серйозні економічні збитки. Стратегії боротьби з хворобами включають використання кількісно стійких сортів та сівозміну. Однак ефективний контроль хвороби можливий лише у поєднанні з своєчасним застосуванням фунгіцидів після виявлення порогових рівнів. Гриб має високу репродуктивну здатність при швидких циклах утворення спор 9-12 днів у польових умовах. Завдяки високій генетичній мінливості, швидкому утворенню спор, поліциклічності та здатності викликати епідемії, які можна контролювати лише за допомогою повторного обприскування, Cercospora beticoIa належить до групи класичних патогенів  високого ризику.

Стійкість до фунгіцидів бензимідазол-карбонат метилу (MBC)

Протягом 70-х років минулого століття генетична характеристика гриба піддавалася дії сполук бензимідазолу (MBC-фунгіциди, категорія В1 (1), Комітет із питань запобігання стійкості до дії фунгіцидів (FRAC), 2017). Ця сполука діє на область формування грибкових мікротрубочок та часто використовується для боротьби з численними грибковими захворюваннями економічної важливості як фунгіцид широкого спектру дії. Бензимідазоли були першими системними, проникаючими, безконтактними та надзвичайно ефективними фунгіцидами у малих дозах. Однак, завдяки високій специфічності стійкість, заснована на модифікації цільового організму, була виявлена ​​досить рано у декількох видів грибів, включаючи Cercospora beticoIa. Як і в більшості інших грибкових патогенів, стійкість Cercospora beticoIa пов’язана з точковою мутацією β-тубулін гена, внаслідок чого в місці зв'язування бензимідазолу змінюється склад амінокислот. У Cercospora beticoIa ця мутація викликає помірний або високий рівень стійкості без значних втрат пристосованості, в результаті чого відбувається часткова втрата сполуки для контролю церкоспорозу в різних країнах світу. Комітет із питань запобігання стійкості до дії фунгіцидів (FRAC) включив фунгіциди бензимідазол-карбонат метилу (MBC) до категорії високого ризику. У даний час у Німеччині для боротьби з церкоспорозом зареєстрована сполука-MBC тіофанат-метил, однак відсутня інформація про появу та поширення резистентних штамів. Впроваджено методи моніторингу стійкості цільових організмів до фунгіцидів бензимідазол-карбонат метилу (MBC) шляхом виявлення мутацій. Вони дозволяють проводити прямий скринінг на виявлення стійкості в польових популяціях.

Стійкість до фунгіцидів інгібіторів зовнішніх хінонів (QoI) (стробілуринів)

Ще одна важлива група фунгіцидів, що використовуються для боротьби з грибковими захворюваннями сільськогосподарських культур, представлена фунгіцидами інгібіторів зовнішніх хінонів, винайдених у середині 1990-х років (категорія 11 (С3), FRAC, 2017). Вони є одноцільовими інгібіторами і діють на всі важливі грибкові види (включаючи аскоміцети, базидіоміцети та ооміцети). QoI-фунгіциди зв'язуються з цитохром-bс1-комплексом і блокують передачу електронів від комплексів цитохрому b і цитохрому c1, що викликає дефіцит енергії цільового організму. Цитохром b кодується геном цитохрому b (cytb) і точковою мутацією, як G143A, про які повідомлялося у більшості грибкових патогенів, стійких до Qol та відповідальних за стійкість. Оскільки ця мутація, здається, не пов’язана з втратою пристосованості, не дивно, що для прояву стійкості в різних грибкових патогенів знадобиться лише декілька років застосування певного препарату. Тим часом, більше 20 подібних збудників проявили стійкість, але не одночасно, а з певною затримкою. Під час моніторингових заходів у США, Франції та Італії у Cercospora beticoIa було виявлено стійкість до фунгіцидів інгібіторів зовнішніх хінонів (Qol). Основні механізми стійкості, включаючи відсутність втрати пристосованості, викликали прояв високого ризику для QоI-фунгіцидів, що пов'язано з "розповсюдженим і серйозним зниженням ефективності через розвиток стійкості в одного або декількох цільових патогенів у певних регіонах протягом декількох років застосування препарату".

Щоб виявити докази поширення або прояву стійкості до Qol-фунгіцидів у популяціях Церкоспори в інших європейських країнах, IfZ та BASF провели моніторингові дослідження (Графік 1). Для виявлення мутації G143A в cytb була розроблена кількісна аллель-специфічна полімеразна ланцюгова реакція (qPCR), яка дозволила дослідити велику кількість уражених зразків з одного поля для визначення частки стійких ізолятів у польовій популяції.

Оскільки частка ізолятів, стійких до стробілуринів, була досить змінною, можна зробити висновок, що менша щільність відбору проб, ймовірно, може пропустити певні ділянки, що призведе до неправильного визначення стійкості та ризику. Здається, що конкретне поле, час перебігу епідемій та ефективність співвідносяться зі станом резистентності популяції. Розроблений метод допоможе оцінити ефективність заходів щодо управління стійкістю у майбутньому. Очевидно, що розширення посівної площі цукрових буряків та сприятливі погодні умови збільшують ризик розвитку захворювань та інфекційність інокулята, що призводить до більш ранніх та сильніших епідемій. Загалом це збільшує ризик розвитку та поширення стійкості до фунгіцидів.

Графік 1. Відсоток стійких до стробілуринів ізолятів Cercospora bericola в районах вирощування цукрових буряків у різних країнах визначається мутацією cytb, що призводить до обміну амінокислот G143A в цитохромі b. Результати моніторингу: 2014 (n = 65), 2015 (n = 68) та 2016 (n = 72); червоний: > 75%, помаранчевий: 30-75%, жовтий: 10-30%, зелений: 2-10%, синій: 0-2% (дані BASF, IfZ, EpiLogic, Erven та ін., 2017)

Стійкість до інгібіторів деметилювання (DMIs)/інгібіторів біосинтезу стеролів (SBI)

Інгібітори деметилювання (DMIs) (G13), FRAC, 2017), включаючи азолові сполуки, — ще один дуже успішний, якщо не найважливіший клас фунгіцидів у сільському господарстві, який вперше вийшов на ринок у 1970-х роках. DMls перешкоджають стадії біосинтезу клітинної стінки грибів, а саме стеролу С-14 а-деметилювання 24 метилендигідроланостеролу, попередника ергостеролу. Переваги, що ведуть до популярності сполук групи DMIs, можна віднести до протигрибкової активності широкого спектру дії (захисна та лікувальна) з низькими рівнями фітотоксичності. Однак у багатьох грибкових патогенів, включаючи C. Beticola, було виявлено стійкість до DMls. Комітет з питань запобігання резистентності до дії фунгіцидів (FRAC) оцінює наявний ризик, пов'язаний з DMls, як помірний або середній (зниження ефективності, виявлене в декількох ситуаціях, або в обмеженій мірі, та/або стійкі ізоляти, виявлені в польових зразках цільових патогенів) (Таблиця 2).

У декількох фітопатогенних грибів спостерігалися мутації в гені 14a-нікотин-деметилази (Cyp51). Вони уникають зв'язування інгібіторів деметилювання (DMI), але підтримують функцію білка. Інші мутації, тобто в області промотору, призводять до надмірно вираженого цільового білка CYP51 або збільшення активності мембранних транспортних білків, що призводить до посиленого виходу інгібіторів деметилювання (DMI) з цільової клітини. Ці транспортери представлені АТФ-зв'язуючими касетами (ABC) або білками-транспортерами суперсімейства мембранних транспортерів (MSF). Стійкість грибів до азолів відноситься до кількісного (зміщувального) типу і пов'язана з пристосованістю патогена. Проведені дослідження виявили посилений та DMI-індукований CYP51, що відповідає за знижену в лабораторних умовах стійкість ізолятів C. bericola. За допомогою транскриптомічного підходу було виявлено переекспресію кластеру генів вторинного метаболіту, а також генів, що беруть участь у фортифікації клітинних мембран, щоб представити молекулярну основу для зниженої стійкості C. bericola до інгібіторів деметилювання (DMl). Класичний спосіб аналізу стійкості C. bericola до DMl включає ізоляцію збудника та визначення концентрації EC₅₀ в лабораторних умовах. Було виявлено підвищення значень EC₅₀ для різних азольних сполук, використовуваних для контролю церкоспорозу в США, порівняно з чутливим еталонним ізолятом.

Щоб навести докази зменшення ефективності та виключити інші фактори, такі як щільність інокуляту, умови навколишнього середовища, було виявлено помилки вегетаційного досвіду з інокуляцією та лікуванням епоксиконазолом (лікування, 3 дні після інокуляції; захист, за день до інокуляції) у різних дозах (0, 11, 33, 100% зареєстрованої дози). У пробі були використані три ізоляти з різною чутливістю (Графік 2). Однак, через два тижні після фунгіцидної обробки можна виявити лише незначні зміни в ефективності. Цей експеримент не виявив взаємозалежності між чутливістю в лабораторних умовах та ефективністю фунгіциду в польових умовах. Це вказує на те, що у випадках кількісної стійкості моніторинг може виявити низький рівень кількісної стійкості до того, як проявиться польова стійкість. Це підкреслює необхідність проведення моніторингових заходів для правильної оцінки ризиків.

Графік 2. Відносна фунгіцидна ефективність ізолятів Cercospora beticola з високим рівнем чутливості in vitro (EC₅₀ = високий), середньою чутливістю (EC₅₀ = середній) та низькою чутливістю (EC₅₀ = низький) до епоксиконазолу через два тижні після інокуляції. Різні дози епоксиконазолу застосовували для захисту (за добу до інокуляції) або як лікування (за три дні після інокуляції). Стовбці похибок представляють стандартне відхилення

На додаток до додосліджень у польових умовах, у двох регіонах із відомими проблемами контролю проводились фунгіцидні польові експерименти з природною інфекцією. Для контролю церкоспорозу на чутливих сортах цукрових буряків застосовувався азоксистробін у поєднанні з усіма трьома доступними азоловими сполуками. Ринкові продукти (з поодинокими сполуками) застосовували два рази, після досягнення порогових значень захворювання. Окрім визначення ступеня тяжкості захворювання (DS,% ураженої поверхні листків) було визначено стан стійкості до стробілурину та значення EC₅₀ епоксиконазолу для 20 ізолятів у лабораторних умовах. На Графіку 3 показано мінливий показник ступеня тяжкості захворювання (DS) для необроблених ділянок в обох регіонах. Чутливість до азолу знаходилась в нижньому або середньому діапазоні в м. Макофен (Німеччина) та на більш високому рівні в Нордгаймі. Тим не менш, в обох регіонах епоксиконазол проявив високу ефективність. Це підтвердило твердження про те, що аналіз in vitro може виявити зміни до того, як виникнуть проблеми практичного контролю. Проте, cполуки дифеноконазолу та тетраконазолу продемонстрували явно знижену ефективність, що може бути пояснено специфічними змінами сполуки. Відсоток популяції збудника цекроспорозу з стійкістю до стробілурину становив 92% у Макофені та 38% у Нордгаймі, показавши ефективність азоксистробіну.

Графік 3. Зміни ступеня тяжкості захворювання Cercospora beticola після застосування двох фунгіцидних обробок (азоксистробіном та різними азольними сполуками) після досягнення порогових значень захворювання, порівняно з необробленим ділянками у двох регіонах Німеччини (м. Макофен та м. Нордгайм), 2016; Азоксистробін («Ортіва» 1,0 л/га), Дифеноконазол («Скор» 0,4 л/га), Тетраконазол («Домарк» 10 ЕС 1,0 л/га), Епоксиконазол («Опус «1,0 л/га)