За матеріалами статті на тему «Оцінка ризику стійкості до пестицидів у патогенів, шкідників та бур’янів цукрових буряків» («Risk assessment for pesticide resistance in sugar beet pathogens, pests and weeds») журналу «Цукрова галузь» («Sugar Industry») 143 (2018) №68.

Із самого початку історії вирощування сільськогосподарських культур, усі рослини завжди необхідно було захищати від шкідників, хвороб та бур’янів, щоб забезпечити стабільно високу врожайність та, в кінцевому підсумку, отримати продукцію високої якості. Без захисту культури втрати врожаю можуть досягати 50-80% у світових масштабах. Без ефективної хімічної боротьби зі шкідниками, патогенами та бур’янами екологічно прийнятна інтенсифікація сільськогосподарського виробництва була б неможливою протягом останніх 70 років. Зміни принципу дії пестицидів (MoA) від неспрецифічних сполук до молекул, які виконують певні цілі, відбулися внаслідок суворіших положень щодо захисту навколишнього середовища, а, отже, більш жорсткого порядку реєстрації пестицидів. Неспецифічні сполуки виконують групові біохімічні функції у цільовому організмі (так звані багатоцільові інгібітори) і не мають системної активності, що потребує збільшення їх дози. Моноспецифічні пестициди виконують системну та лікувально-профілактичну функції, безпечніші як для ссавців, так і для нецільових організмів і потребують меншої дози застосування. Однак ці укрощатьдосягнення спровокували розвиток стійкості до пестицидів у численних патогенних грибів, різних видів бур’янів та шкідників сільськогосподарських культур. У декількох випадках, ця швидка еволюція у відповідь на неодноразове застосування пестицидів призвела до (часткової) втрати ефективних класів пестицидів, і сьогодні це є основною загрозою ефективного сільськогосподарського виробництва. Однак, інноваційний розвиток пестицидів дуже необхідний, адже перспективи розвитку інтенсивного захисту рослин повинні змінюватися. Тому потрібно довести ефективність наявних сполук. Втрата продуктивності завжди дорого обходиться як для фермера, так і для компанії-виробника ЗЗР, навколишнього середовища та суспільства, оскільки повинні передбачатися нові рішення щодо захисту сільськогосподарських культур. Тому потрібно запобігати та перешкоджати розвитку стійкості, затримувати або підтримувати її на низькому рівні якомога довше, а в разі її прояву — здійснювати ефективне регулювання. Необхідно зрозуміти принципи, що лежать в основі походження стійкості, та фактори, що викликають та впливають на її розвиток і поширення. Виділення та збільшення стійкості у популяціях шкідників та патогенів відбувається з певною вірогідністю, яку можна визначити як ризик. Цей ризик розвитку стійкості залежить від декількох факторів (таких як хімічний клас, біологія патогенів/шкідників та агрономічні фактори), а тому змінюється, в залежності від груп пестицидів та видів шкідників/патогенів.

Мета даного дослідження — виділити основи розвитку стійкості до пестицидів, включаючи важливі механізми, фактори та складові оцінки ризику, переглянути найпоширеніші види бур’янів, патогенів та шкідників цукрових буряків, а також сполуки, які зараз використовуються для їх контролю та загрожують розвитком стійкості. Результати проведених досліджень допоможуть розробити план протидії розвитку стійкості включаючи тактику специфічних профілактичних заходів та управління стійкістю.

Як виникає стійкість до пестицидів

Поняття стійкості до пестицидів

Стійкість — це природне спадкове регулювання здатності окремих особин у популяції зберігати життєздатність, незважаючи на дію засобів захисту рослин, які зазвичай забезпечують ефективний та діючий контроль. Незважаючи на те, що стійкість часто можна наочно продемонструвати в лабораторних умовах, це ще не означає, що в польових умовах ефективність боротьби з патогенами чи бур’янами зменшується. «Практичний опір» — це термін, що стосується втрати контролю в польових умовах через зміну чутливості. Після «поразки» пестицидів необґрунтоване твердження про те, що в усьому винна стійкість, вимагає детальнішого розуміння принципу дії пестицидів (MoA), механізму специфічної стійкості та розробки методів моніторингу. Важливо усунути інші можливі причини неефективної дії пестицидів, такі як проблеми зі зберіганням чи застосуванням продукту (наприклад, неправильне визначення необхідної дози застосування) чи нетипові природно-кліматичні умови під час та після їх застосування.

Необхідно відзначити, що здатність виживати попри дію пестицидів заснована на генетичному рівні і що мутація(-ї) спадкових генів та/або регуляторних елементів виникають природним чином в окремих особин у популяції, на яких впливає застосований препарат. Пестицид — це завжди єдиний селективний засіб. Погіршення дії пестицидів викликається не однією особиною; організм повинен вижити, щоб виробити цю характерну особливість та передати її своїм нащадкам, а при наступних обробках пестицидами з тим же специфічним принципом дії (MoA) стійкість повинна знову проявитися для зменшення чутливості особин. Для виявлення «практичного опору» необхідно спостерігати за збільшенням кількості стійких особин у популяції допоки пестицид не припинить забезпечувати прийнятний рівень захисту рослини. Не варто плутати стійкість з толерантністю, яка може виникати після сублетального впливу на інсектициди, але на генетичному рівні не передається нащадкам. 

Якісна та кількісна стійкість

Більш загальна класифікація різних механізмів можлива шляхом перегляду ефектів та рівня стійкості. Повна втрата або значне скорочення показників урожайності в більшості випадків викликається «якісною (або руйнівною) стійкістю». Для втрати чутливості необхідний лише один дискретний крок, викликаний мутацією цільового організму. Ще одним важливим критерієм є те, що лише під час процесу ретельного відбору можуть бути виявлені чутливі та стійкі особини, не виявляючи жодних рівнів проміжної стійкості. Досить цікаво те, що ці мутації жодним чином не пов'язані з втратою пристосованості або вірулентності. На відміну від цього, мутації полімерних генів формують генетичну основу в популяції для визначення «кількісної (або змінної) стійкості». Зміна популяції відбувається повільно і вимагає декількох етапів відбору. Ефективність продукту зменшується, але повністю не зникає, оскільки кожної окремої мутації не достатньо для того, щоб викликати повну втрату ефективності. Так як деякі зміни, необхідні для досягнення практичної «польової стійкості», можуть бути пов’язані з погіршенням пристосованості, ефективність може бути частково реверсивною. Протягом декількох етапів відбору з'являються особини з проміжними та високими ступенями зниженої чутливості.

Механізми стійкості

Механізми, які використовують патогени, шкідники та бур’яни для виживання, незважаючи на дію пестицидів, дуже різноманітні та поділяються на декілька категорій. Стійкість до фунгіцидів може викликатися різними механізмами, включаючи:

1. видозмінений цільовий об’єкт із зменшенням зв'язуючих сполук;
2. синтез альтернативного білка, здатного заміщати цільовий об’єкт;
3. спалах популяцій шкідників;
4. активний ефлюкс (виведення препарату з клітини) або зменшення поглинання фунгіциду;
5. метаболічна детоксикація фунгіциду з клітини.

Процеси, які дозволяють бур’янам виживати після дії гербіцидів, подібні. Механізми, що лежать в основі їх стійкості, поділяються на дві категорії: стійкість до цільових об’єктів (TSR) та стійкість до нецільових об’єктів (NTSR). У випадку TSR, мутації викликають структурні зміни об’єкту зв'язування гербіцидів; у випадку протилежного варіанту, цільовий об’єкт надмірно експресується, що викликається ампліфікацією цільових генів. Принципові механізми дії NTSR в основному зменшують кількість молекул гербіцидів, які досягають цільової ділянки за допомогою різних механізмів. Окрім цільового об’єкта, метаболічна стійкість (детоксикація, секвестрація) та стійкість до проникнення (уповільнення адсорбції через збільшення бар'єру клітинної мембрани), комахи також можуть зменшувати чутливість до інсектицидів шляхом поведінкової стійкості. У цьому випадку комахи вчаться виявляти або розпізнавати небезпеку та уникати токсичної речовини. Однак особливості метаболічної стійкості дуже ризикові для комах, тощо, адже можуть впливати на їх репродукцію.

Виявлення характерних ознак стійкості — моніторинг

Сучасні знання про поширення, еволюцію та вплив шкідників цукрових буряків, включаючи оцінку ризиків, базуються на моніторингу та спостереженнях. Передбачається, що частка стійких мутантів із якісною стійкістю повинна досягати 1% у популяції, щоб його можна було виявити на практиці. Якщо загальна ефективність дії пестициду порівняно низька, ймовірність виявити резистентних особин зменшується. Непрактично велику кількість зразків потрібно перевірити, щоб виявити стійких особин. Згідно статистичних даних, для отримання 95% шансу на виявлення резистентності з часткою 1%, у цілому, необхідно 300 зразків. У випадку кількісної стійкості, велика кількість відповідних мутантів може виникати без практичної втрати контролю над хворобою, що збільшує шанси вчасно виявити проблему. Коли традиційні методи виявлення стійкості порівнюються із сучасними молекулярними методами (див. нижче), стає очевидним, що кількість випробувань може помітно збільшитися.

Методи виявлення стійкості до пестицидів

Що стосується фунгіцидів, то класичний спосіб виявлення стійкості вимагає трудомісткої та довготривалої ізоляції польових ізолятів для подальшого вирощування «чистої» культури та проведення тестів на визначення чутливості до фунгіцидів (визначення концентрації EC₅₀ в лабораторних умовах; концентрація, що знижує ріст або проростання спор на 50%). У польових умовах фунгіцидна обробка ізолятів дає більш достовірні дані по ефективності, але вимагає ще більшої роботи, тому є економічно невигідною. Обмежена кількість ізолятів вважається дуже критичним значенням, так як потенційно їх можна проаналізувати традиційними методами.

Методи виявлення стійкості бур’янів до гербіцидів ще більш трудомісткі, тому що з підозрілих ділянок потрібно відбирати насіння або цілі рослини і може знадобитися проведення аналізів у польових умовах. В тепличних умовах біоаналізи, перевірки розсади, аналізи відростків або флюоресцентні тести вимагають ведення протоколів та постійних умов росту. Ферментні біоаналізи та методи, що використовують ¹⁴С-радіомічені з’єднання, дозволяють охарактеризувати секвестрацію гербіцидів, але вимагають багато часу. Перед традиційним моніторингом необхідно провести повторні та рандомізовані тести, щоб визначити залежність реакції від дози в контрольованих умовах, використовуючи цілі рослини та значення GR₅₀ (GR — зменшення росту, доза, необхідна для зменшення маси відростків на 50%, порівняно з необробленими рослинами).

Методи виявлення стійкості до пестицидів на основі нуклеїнової кислоти мають ряд переваг, включаючи високу пропускну здатність, специфічність, чутливість, репрезентативність та високу ймовірність виявлення стійкості. Однак ці переваги можна використовувати лише тоді, коли механізми стійкості були виявлені на молекулярному рівні. У випадку якісної стійкості до цільових об’єктів на основі одинарних мутацій, ефективним рішенням є молекулярні методи, такі як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), секвенування ампліконів (піросеквенування), поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів ПЛР (ПЛР-ПДФР), аллель специфічна ПЛР та ПЛР у реальному часі. Виявлення стійкості може бути мультиплексним, коли використовується гібридизація, і її можна мінімізувати у наборах ДНК, так званих ДНК-чіпах. Замість трудомісткої ізоляції збудника потрібно лише провести відбір проб тканин та/або ДНК (тканин рослин-бур’янів та уражених хворобою частин рослини). Це має особливе значення у випадку облігатно-біотрофних патогенів. Кількісний аналіз на основі ДНК певної мутації/ознаки мутації дозволяє відібрати більшу кількість індивідуумів із популяції. Тим самим можна отримати кількісні оцінки або оцінки стану певного поля або регіону.

Оцінка ризику

У цьому розділі визначаються загальні ключові фактори стійкості до пестицидів, пов'язані з її походженням, розвитком та поширенням на різних цільових організмів, господарів та комбінацій пестицидів. Оцінка ризику повинна керуватися масштабом антирезистентних стратегій з метою уповільнення або навіть запобігання поширення стійкості. Однак необхідно відзначити, що неможливо точно передбачити розвиток стійкості до конкретної сполуки. З цією метою завжди було важливо робити висновки про ризики з існуючих випадків для  новорозроблених сполук із тим же принципом дії пестицидів (MoA). Тим часом в ЄС оцінка ризику є необхідною складовою процесу регулювання для затвердження кожного фунгіциду. Європейська і Середземноморська організація захисту рослин (EPPO) радить реєстраційним органам та заявникам на реєстрацію як проводити оцінку ризику. Ризик практичної стійкості — це поєднання спадкових факторів та факторів, пов'язаних з умовами використання продукту. Агрономічний ризик може модифікуватися системою посіву, сівозміною, заходами комплексної боротьби зі шкідниками (КБШ), такими як вибір стійких або сприйнятливих сортів. На противагу цьому, ризик патогенів та пестицидів не може відчувати вплив. Ризик патогенів визначається генетичним складом та біологією організму; ризик пестицидів — хімічними характеристиками та принципом дії пестицидів (MoA). Для поєднання трьох важливих факторів були розроблені та оцінені матриці ризиків, тобто, для оцінки фунгіцидного ризику. У матрицях ризиків комбіновані ризики обчислюються за допомогою множення числових значень окремих факторів ризику. За даними ФАО, в цілому ризик можна оцінити, визначивши ці три фактори для кожної ситуації пестицид-шкідник-культура (Табл. 1-3).

Таблиця 1. Фактори оцінки ризику патогенів (за даними ФАО (2012 р.) зі змінами), який поділяється на біологічні та генетичні фактори