За матеріалами статті на тему «Додавання селену під час ферментації бурякової меляси та Saccharomyces cerevisiae для збільшення виробництва біоетанолу» («Selenium supplementation during fermentation with sugar beet molasses and Saccharomyces cerevisiae to increase bioethanol production») журналу «Зелена переробка та синтез» («Green Processing and Synthesis») 8, 2019 р.

У ряді досліджень було показано, що під час виробництва біоетанолу шляхом ферментації на його вихід впливають численні параметри, такі як тип та об'єм інокуляту (штаму мікроорганізмів), склад і концентрація субстрату (середовище росту), рН, температура, осмотичний тиск культурального середовища та наявність поживних речовин, мінералів та попередників. Селен, як важливий мікроелемент, відіграє важливу роль у житті тварин, здоров’ї людини та мікро/макрофлорі. Але через низьку концентрацію селену в овочах (як раціон харчування) та коротку біологічну доступність, багато людей відчувають дефіцит цього життєво важливого елементу. Перетворення селену в органічні сполуки селену, такі як селенобілки (особливо селенометіонін та селеноцистеїн) та селеноферменти, зменшує його дефіцит в організмі людини та підтримує біологічну активність, таку як антиоксидантна та протизапальна активність. Декілька досліджень показали, що клітини дріжджів здатні поглинати селен і біотрансформувати його в селенометіонін та селеноцистеїн. Дріжджі, збагачені селеном, які відомі як селенізовані дріжджі, є найбільш популярною основою багатьох споживаних добавок. Наприклад, збагачені селеном дріжджі, такі як Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus та S. boulardii, використовуються для виробництва хліба, пробіотичних продуктів та алкогольних напоїв. Декілька досліджень показали, що глутамат у дріжджах може зменшувакти виробництво енергії та швидкість ферментації, змінюючи структуру та динаміку мітохондрій, що негативно впливає на організм та може запобігти такому органічному селену, як селеноцистеїн, який утворюється в процесі біотрансформації неорганічного селену з використанням дріжджів, таких як S. cerevisiae. Інші дослідження показали, що під час виробництва біоетанолу шляхом процесу ферментації вміст органічного селену в S. cerevisiae збільшувався зі збільшенням концентрації селену до 2 мкг/мл з наступним поступовим зменшенням через 24 години інкубації. Це показує низьку біологічну доступність органічного селену. Крім того, деякі види Saccharomyces, такі як Yarrowia lipolytica, стійкі до селену, тому менші кількості селену не можуть суттєво стримувати їх ріст. Наскільки відомо, немає жодного комплексного дослідження, яке визначало б вплив концентрації селенової солі та культурального середовища на виробництво біоетанолу шляхом процесу зануреної ферментації з використанням S. cerevisiae та бурякової меляси. Крім того, механізм селену у виробництві біоетанолу з використанням S. cerevisiae невідомий.

Отже, основними цілями даного дослідження було: І) визначати вплив селену на концентрацію виробленого біоетанолу, ІІ) оптимізувати параметри зануреної ферментації, а саме концентрацію субстрату та селену для досягнення найвищої концентрації біоетанолу та ІІІ) порівняти концентрацію біоетанолу, виробленого з та без селену.

Матеріали та методи

Матеріали

Постачальником бурякової меляси як субстрату була компанія Sahand Company (м. Хой, Іран). Вона мала 74,07°Bx, загальну зменшену кількість цукру 48,65%, 6,16 pH, вміст золи 9,6% об./об. та щільність 1,358 × 103 кг/м³. Комерційний штам S. cerevisiae, SFO6, був наданий компанією Iran Mayeh Company (м. Тегеран, Іран). 30% об./об. сірчаної кислоти (як регулятор рН), діамонійний гідрофосфат (як джерело фосфору) та сечовина (як добавка азоту) були надані компанією Dr. Mojallali Company (м. Тегеран, Іран). був Постачальником селеніту натрію (Na₂SeO₃) з чистотою вище 99% (у якості попередника селену) була компанія Merck (Merck Co., м. Дармштадт, Німеччина).

Підготовка інокуляту за допомогою аеробного процесу

Мелясу стерилізували за допомогою лабораторного стерилізатору (RT-1, Reyhan Teb, м. Тегеран, Іран) при температурі 121°C і тиску 1,5 бар протягом 15 хв, розбавляючи за допомогою стерилізованої дистильованої води для отримання розбавленої меляси з градусом Бриксу 11 (°Bx) за допомогою рефрактометра (Index instrument Ltd., Kissimmee, Флорида, США), насиченої 250 мг/л сечовини та 500 мг/л сечовини з діамонійним гідрофосфатом, рН було доведено до 4,2. Після цього підготовлений субстрат, що містив 0,3 г/л промислових дріжджів, провітрювали за допомогою шейкер-інкубатора (S1-300, Jeio Tech, Теджон, Корея) 120 об./хв, 1 (об./об./хв) при 32°C протягом 24 годин.

Ріст S. cerevisiae у підготовленій мелясі

Вимірювання оптичної щільності використовувалося для контролю росту S. cerevisiae у мелясі з 11°Bx, як зазначено при підготовці інокуляту за допомогою аеробного процесу. Для визначення впливу кількості селену (0, 5, 10, 15, 20 і 25 мкг) на ріст S. cerevisiae, після приготування меляси, що містила 0,3 г/л дріжджів, додавалася певна кількість селену, а поглинання підготовлених зразків як оптичну щільність вимірювали через кожну годину, використовуючи спектрофотометр UV-Vis (спектрофотометр Jenway UV-Vis 6705, Стаффордшир, Великобританія), відрегульований на довжині хвилі 625 нм. Для цього зразки 4 рази розбавлялися дистильованою водою, щоб зменшити інтенсивність забарвлення, а після цього їх піддавали спектрофотометру. Потім отримані значення множили на 4, щоб отримати точне значення оптичної щільності для зразків.

Виробництво біоетанолу шляхом анаеробної зануреної ферментації та визначення його концентрації

Біоетанол отримували шляхом анаеробної періодичної зануреної ферментації, коли 60 мл підготовленого інокуляту з 11°Bx та різну кількість селеніту натрію (5-25 мкг) додавали в 140 мл розведеної та стерилізованої меляси з різним градусом Бриксу — від 10 до 25°Bx. Потім розчини суміші переливали в 250 мл скляні посудини, ущільнені гумовою прокладкою, та витримували при 32°С протягом 32 годин. Нарешті, концентрацію виробленого біоетанолу розраховували, використовуючи методику, засновану на дистиляції. Таким чином, після дистиляції біоетанолу та вимірювання фактичного градусу Бриксу в дистильованому ферментативному бульйоні за допомогою рефрактометра (Index instrument Ltd., Kissimmee, Флорида, США), за допомогою ареометра визначали концентрацію біоетанолу.

Експериментальне проектування та статистичний аналіз

За даними літературних досліджень, дві незалежні змінні, а саме кількість селеніту натрію (мкг, X1) та Брикс субстрату (°Bx, X2), були обрані для визначення їх впливу на концентрацію біоетанолу (г/л, Y) як змінної реакції, використовуючи методологію поверхні відгуку (RSM). Центральне композиційне планування (CCD) було використано для проектування 13 експериментів (Таблиця 1), заснованих на системі осьових точок та 1 блоку. Для моделювання концентрації біоетанолу (г/л, Y) як функції двох вибраних незалежних змінних, було використано поліноміальне рівняння другого порядку. Придатність отриманої моделі вивчалася на основі коефіцієнта детермінації (R²) та невідповідності р-значення. Для визначення значущості отриманої моделі використовувався дисперсійний аналіз (ANOVA) на основі терміну р-значення (р < 0,05). Для експериментального проектування та статистичного аналізу було використано програмне забезпечення Minitab (v.16 статистичний пакет, Minitab Inc., Пенсільванія, США).

Оптимізація умов ферментації біоетанолу

Було побудовано контурний графік для того, щоб знайти оптимальну площу з заданим діапазоном змінних ферментації. Крім того, для отримання точних значень оптимізованих умов ферментації, в яких було вироблено біоетанол із найвищою концентрацією, використовувалася чисельна оптимізація. Для перевірки достовірності статистичного експериментального методу було проведено три додаткових контрольних випробування в отриманих оптимальних умовах. З цієї причини було визначено порівняльний критерій Тьюкі для значень прогнозованої та експериментальної концентрації біоетанолу в отриманих оптимальних умовах ферментації. Для процедур оптимізації та перевірки було використано програмне забезпечення Minitab (v.16 статистичний пакет, Minitab Inc., Пенсільванія, США).

Таблиця 1. Центральне композиційне планування (CCD) виробництва біоетанолу з використанням S. Cerevisiae

*Недопустиме значення

Результати та обговорення

Вплив селену на ріст S. Cerevisiae

Вплив різної кількості селену на ріст S. cerevisiae (проявляється як інтенсивність помутніння) показано на Рис. 1. На графіку чітко видно, що без селену ріст дріжджів у мелясі був значно (р < 0,05) вищим, ніж із селеном. Відповідно до Рис. 1, нахил кожної кривої, як швидкість росту, розраховували від початку експериментів до 14 годин після інкубації. Отримані результати показали, що швидкість росту S. cerevisiae (проявляється як інтенсивність помутніння (% о.п.)) у зразках, що містили 0, 5, 10, 15, 20 і 25 мкг селену, становила 0,1707, 0,1678, 0,1679, 0,1664, 0,1627 та 0,160% о.п./год відповідно. Порівняльний критерій Тьюкі показав, що існувала незначна (р > 0,05) різниця у швидкості росту S. cerevisiae (проявляється як інтенсивність помутніння) у зразках, що містили S. cerevisiae та 5-25 мкг селену. Це може бути пов’язано з нижчою біологічною доступністю органічного селену в S. cerevisiae. У проведених раніше дослідженнях було виявлено, що деякі види Saccharomyces мають стійкість до селену, тому менші кількості селену не можуть суттєво пригнічувати їх ріст.

Рис. 1. Вплив різної кількості селену на ріст S. Cerevisiae

Вплив Бриксу субстрату та кількості селену на концентрацію виробленого біоетанолу

Відповідно до проведених експериментів та отриманих значень концентрації виробленого біоетанолу шляхом зануреної ферментації (Таблиця 1), модель другого порядку призначена для кореляції концентрації біоетанолу з параметрами бродіння, а саме кількістю селену та Бриксом субстрату. У Таблиці 2 чітко видно, що кількість селену та його взаємодія із Бриксом середовища мали незначний (р > 0,05) вплив на концентрацію біоетанолу. Але основний та квадратичні параметри ферментації, а також Брикс мали значний (р </> 0,05) вплив на концентрацію виробленого біоетанолу. Це означає, що при визначених діапазонах для незалежних змінних концентрація виробленого біоетанолу впливає на нижчий і вищий Брикс середовища і лише більші кількості селенової солі. Статистичний аналіз також показав високі значення R² (0,9997) та втрати при обробці результатів експерименту (р-значення 0,420) отриманої моделі, що вказувало на придатність та точність моделі для прогнозування концентрації біоетанолу у визначених діапазонах параметрів ферментації.

Таблиця 2. Р-значення та коефіцієнти регресії для отриманої моделі з використанням S. cerevisiae

1: Кількість селену (мкг)

2: Брикс субстрату (°Bx)

Як видно з Таблиці 1, концентрація виробленого біоетанолу варіювалася від 15 до 55 г/л. На Рис. 2 вказується вплив кількості селену та Бриксу субстрату на концентрацію виробленого біоетанолу. Як видно, при будь-якій постійній кількості селену, збільшуючи Брикс субстрату, концентрація біоетанолу також збільшується. Цей результат узгоджується з даними інших досліджень, які вказували на те, що, збільшуючи Брикс субстрату, збільшується концентрація ферментованого цукру, що, в свою чергу, збільшує концентрацію виробленого біоетанолу. Одним із факторів, який може сильно впливати на ефективність ферментації, є осмотичний тиск середовища, який підвищується за рахунок збільшення Бриксу і може негативно впливати на ріст дріжджів та виробництво біоетанолу. При будь-якому постійному Бриксі субстрату, збільшуючи кількість селену, концентрація виробленого біоетанолу збільшується. Однак вплив Бриксу субстрату на збільшення концентрації біоетанолу був більшим, ніж селену, через нижчу р-величину (0,000). Відсутність відхилень на Рис. 2 також продемонструвала, що взаємодія між Бриксом субстрату та кількістю селену не мала значного (р < 0,05) впливу на концентрацію біоетанолу. Отриманий результат був підтверджений досягнутим високим значенням (р > 0,05) р-параметру ефекту взаємодії (0,189).

Рис. 2. Графік концентрації виробленого біоетанолу (г/л) у залежності від Бриксу субстрату (°Bx) та кількості селену (мкг) під час зануреної ферментації

Оптимізація процесу ферментації

Отриманий результат чисельної оптимізації показав, що занурена ферментація з використанням 15 мкг селеніту натрію та субстрату з 25°Bx забезпечують виробництво біоетанолу з найбільшим значенням концентрації 55,2 г/л. Як видно на Рис. 3, при будь-якому постійному значенні Бриксу субстрату та низьких кількостях селену, які збільшувалися, концентрація виробленого біоетанолу була постійною, а при більших кількостях селену збільшення його кількості мало значний (р 0,05) вплив на концентрацію біоетанолу. Цей результат було підтверджено статистичними даними щодо незначного впливу менших кількостей селену (р-значення = 0,135) на концентрацію виробленого біоетанолу (Таблиця 2). Графічна оптимізація була проілюстрована таким чином, що у визначених діапазонах незалежних змінних максимум біоетанолу був досягнутий із використанням найвищих значень Бриксу субстрату. Експериментальні дані для отриманої концентрації біоетанолу (55 ± 2 г/л) з використанням оптимальних параметрів ферментації виявили, що між значеннями експериментальної та прогнозованої концентрації виробленого біоетанолу була незначна (р > 0,05) різниця та засвідчили надійність отриманої моделі.

Рис. 3. Графік оптимізації концентрації виробленого біоетанолу (г/л) як функції Бриксу субстрату (°Bx) та кількості селену (мкг) під час зануреної ферментації

У даній роботі селен застосовувався під час зануреної ферментації для визначення його впливу на виробництво біоетанолу. Із цієї причини процес анаеробної ферментації проводився в умовах, аналогічних до оптимальних (без селену). У даному процесі ферментації Брикс субстрату складав 25°Bx, а кількість селеніту натрію дорівнювала нулю. Отримані результати показали, що концентрація виробленого біоетанолу становила 29 г/л, що на 52,3% менше, ніж концентрація біоетанолу, отриманого з використанням 15 мкг селену (55 ± 2 г/л). Отриманий результат можна пояснити тим фактом, що наявний глутамат у дріжджах негативно впливає на мітохондрії, змінюючи їх структуру та порушуючи динаміку, що зменшує виробництво енергії та швидкість ферментації. S. cerevisiae, перетворюючи неорганічний селен у селеноцистеїн, використовувала цю селеноамінокислоту для запобігання впливу цього глутамату. Здається, що S. cerevisiae має високий потенціал для біотрансформації селену в органічні сполуки селену, такі як селенобілки, що було підтверджено висновками багатьох досліджень.