У зв'язку з цим дослідники намагаються покращити ефективність знебарвлення цукрового сиропу за допомогою хімічних або фізичних методів. Хімічні процеси знебарвлення в основному ґрунтуються на окислювальному потенціалі деяких хімічних сполук, таких як діоксид сірки, перекис водню, озон та хлоровані сполуки, які можуть викликати проблеми зі здоров'ям через наявні залишки токсичних сполук. Крім того, ці процеси можуть вимагати проведення додаткових етапів, щоб вивести цукровий сироп на наступні етапи обробки, при цьому слід ретельно підтримувати такі змінні процесу, як рН та температуру. З іншого боку, процеси фізичного знебарвлення базуються на таких методах, як мембранна фільтрація, іонообмінні смоли, адсорбція та флотація. Однак через різноманітні характеристики (хімічні та фізичні властивості, такі як молекулярна структура, молекулярна маса, іонний заряд та гідрофобність) вищезгаданих органічних барвників, а також обмежену селективність або проблеми з безпечністю, пов'язані з деякими з вищезгаданих методів, поєднання цих методів може бути більш ефективним варіантом. Використовуючи два або більше методи знебарвлення, комбіновані методи можуть видалити/зменшити більшу кількість органічних барвників, що призведе до отримання високоякісного та безпечного продукту. Нещодавно проводилося дослідження комбінованого застосування окислення (реакції) Фентона з хімічною коагуляцією для знебарвлення синтетичних та заводських соків цукрової тростини. Дослідження показало, що поєднання реакції Фентона з хімічною коагуляцією підвищило ефективність знебарвлення, порівняно з застосуванням цих методів окремо один від одного. Повідомлялося про максимальне знебарвлення 42% через 2 хв при рН 9, використовуючи іони Fe²⁺ як реагент Фентона, перекис водню та AlCl₃ як коагулянт.

Мезопористе активоване вугілля (АВ) широко використовується у багатьох виробничих процесах, таких як поділ, очищення, каталіз та електроліз. В останні роки воно використовувалося як ефективний адсорбуючий матеріал у процесі знебарвлення цукрового сиропу з огляду на його велику площу внутрішньої поверхні та поверхнево-функціоналізовані групи. Також проводилося дослідження використання комерційного та змішаного на основі бурякового жому активованого вугілля (АВ) для знебарвлення промислового цукрового сиропу та повідомлялося про оптимальні показники знебарвлення до 80% завдяки використанню 0,2-1 г вуглецю на 100 г цукрового сиропу. Ефективність знебарвлення активованого вугілля (АВ) можна збільшити шляхом поєднання процесів простої адсорбції з хімічним оксидуванням. Перекис водню — біорозкладаний окислювач, в результаті його розкладання утворюються активні радикали кисню. Ці активні форми кисню, такі як гідроксильний радикал, можуть розкладати велику кількість органічних сполук до мінералів. Згідно з рівняннями (1, 2), розкладання перекису водню може протікати в присутності активованого вугілля аналогічним шляхом до реакції Фентона.

AC + H₂O₂ → AC⁺ + OH^- + OH^• (1)

AC⁺ + H₂O₂ → AC + H⁺ + HO₂^• (2)

Через ризики безпеки, пов'язані зі зберіганням та транспортуванням перекису водню, виробництво цього окислювача на місці може збільшити безпеку процесу. Фермент глюкозооксидази (GOx) (EC 1.1.3.4) може використовуватися для виробництва пероксиду водню за наявності глюкози як його субстрату екологічно чистим способом, як це показано в рівнянні (3).  

C₆H₁₂O₆ + H₂O + O₂ → C₆H₁₂O₇ + H₂O₂ (3)

Метою дослідження було представити новий комбінований метод знебарвлення бурякоцукрового сиропу. У зв'язку з цим поєднання простої адсорбції (з використанням активованого вугілля (АВ)) та хімічного оксидування (пероксиду водню, виділеного за допомогою ферменту глюкозооксидази (GOx)) використовувалося для одночасної адсорбції та деградації попередників барвників, які утворюються на початкових стадіях обробки сирого сиропу. На цьому етапі активоване вугілля (АВ) діє як адсорбент та одночасно допомагає розкладати перекис водню, утворений ферментативною реакцією глюкозооксидази (GOx) і глюкозою, для отримання гідроксильних радикалів із високим потенціалом розкладання великої кількості органічних барвників. Крім того, було досліджено вплив різних параметрів, таких як рН, температури, концентрації ферменту та субстрату, на ефективність знебарвлення та визначено оптимальний режим роботи.

Дослідження

Матеріали

Під час досліджень бурякоцукровий сироп (66°Bx) зберігався в холодильнику при температурі 4°С. Промисловий фермент глюкозооксидази (GOx) поставляла компанія Kimia Enzyme Co., Іран. Глюкоза та гранульоване активоване вугілля (АВ) (Norit GAC 1240W, активоване парою, середній діаметр 1 мм) були придбані у компанії Sigma Aldrich Co., США. Усі хімічні речовини аналітичного рівня чистоти надавала компанія Merck Co., Німеччина.

Експериментальна процедура знебарвлення бурякоцукрового сиропу

Спочатку рН отриманого бурякоцукрового сиропу доводили до 7 за допомогою 0,1 ммоль розчину NaOH. Після цього зразок нагрівали до 80°С на водяній бані протягом 10 хв для моделювання стадії попередньої обробки сирого сиропу та утворення органічних барвників. Отриманий розчин охолоджувався до 20°С. У комбінованому процесі АВ/GOx розчин ферменту глюкозооксидази (GOx), глюкозу та активоване вугілля (АВ) додавали до 100 мл обробленого сиропу у визначених концентраціях і поміщали у шейкер-інкубатор на дві години зі швидкістю обертання 170 об./хв. Для порівняння, процес також проводився з використанням лише активованого вугілля (АВ) для адсорбції барвника. Крім того, досліджувалася ефективність іммобілізованого ферменту глюкозооксидази (GOx) на частинках активованого вугілля (АВ) щодо знебарвлення цукрового розчину. Під час реакції зразки відбиралися з реакційного середовища та фільтрувалися через фільтрувальний папір Whatman 110. Другу фільтрацію проводили за допомогою керамічного фільтра для видалення дрібних частинок вуглецю.

Спектрофотометричне визначення сиропу

Концентрація сиропу визначалася шляхом вимірювання його адсорбції за допомогою спектрофотометра (спектрометр UV-2100PC UV/Vis Shimadzu, Кіото, Японія) при довжині хвилі 420 нм відповідно до методу Міжнародного комітету по загальноприйнятним методам аналізу цукру (ICUMSA), яка рекомендує цю специфічну довжину хвилі для визначення кольоровості цукру. Ефективність деколоризації розраховувалася за допомогою рівняння (4).

Деколоризація (%) = 100 x (1 – (A_t/A₀)) (4)

Де A₀ — початкова адсорбція бурякоцукрового сиропу; A_t — адсорбція сиропу за заданий час реакції (хв).

Іммобілізація ферменту глюкозооксидази (GOx) на частинках активованого вугілля (АВ)

Для іммобілізації ферменту глюкозооксидази (GOx) на гранульованому активованому вугіллі (АВ) 0,05 г активованого вугілля (АВ) розчиняли в 12,5 мл розчину ферменту глюкозооксидази (GOx) у фосфатному буфері з рН 6,15 і поміщали в шейкер-інкубатор на 150 хв при температурі 25°С. Потім отриману суспензію відокремлювали шляхом центрифугування.

Результати та обговорення

Процес деколоризації ферментативного сиропу

Ефективність запропонованого методу АВ/GOx для деколоризації бурякоцукрового сиропу визначалася шляхом його порівняння з ефективністю знебарвлення, досягнутою застосуванням тільки активованого вугілля (АВ). Оптимальними умовами, визначеними з попередніх експериментів, були: 0,7 г ферменту глюкозооксидази (GOx) і 20 ммоль глюкози, рН 7 і температура 30°C. Весь процес контролювався, отримані результати якого представлені на Рис. 1. Частинки активованого вугілля (АВ) змогли знебарвити бурякоцукровий сироп на 35,29% через 120 хв за допомогою процесу адсорбції. З іншого боку, поєднання активованого вугілля з ферментативною реакцією збільшило знебарвлення сиропу з 10,13 до 68,27% лише за 10 хв, що доводить ефективність реакції хімічного оксидування при розкладанні органічних сполук, наявних у розчині. Через 120 хв ефективність деколоризації досягла 83,68% за допомогою комбінованого застосування AВ/GOx. Збільшення знебарвлення бурякоцукрового сиропу шляхом додавання ферменту глюкозооксидази (GOx) та глюкози може бути пов'язане з розкладанням органічних барвників активними формами кисню, що утворюються в результаті ферментативної реакції. З іншого боку, адсорбція барвників лише на активованому вугіллі (АВ) була обмеженою, а результати знебарвлення значно нижчими.

Вплив концентрації глюкози

У даному дослідженні Н₂О₂ було отримано за допомогою окислювально-відновної реакції між глюкозою та киснем, каталізованої ферментом глюкозооксидази (GOx). Ферментативна активність GOx залежить від багатьох параметрів, таких як концентрація субстрату, температура та рН середовища. Щоб визначити вплив концентрації глюкози, дослідження зі знебарвлення бурякоцукрового сиропу проводилися при кількох концентраціях глюкози (15, 20, 25 та 30 ммоль), де температура становила 30°C, а норма активованого вугілля (АВ) — 0,1 г. Рис. 2 демонструє ефективність знебарвлення цукрового сиропу протягом 120 хв роботи.

За даними Рис. 2, збільшення концентрації глюкози з 15 до 20 ммоль посилило знебарвлення цукрового сиропу, але будь-яке подальше збільшення її концентрації збільшило тривалість процесу знебарвлення. Стосовно ферментативної реакції, виділення пероксиду водню з використанням ферменту глюкозооксидази (GOx) відбувається за моделлю Міхаеліса – Ментена. Відповідно до цієї моделі кінетики, швидкість ферментативної реакції обмежена максимальною швидкістю (r_max), тому будь-яке подальше збільшення концентрації субстрату вище оптимального значення є неефективним щодо швидкості самої реакції. Максимальне знебарвлення було досягнуто при концентрації глюкози 20 ммоль, що узгоджується з оптимальною концентрацією глюкози, зазначеною для цього ферменту Ельхамі, В. та ін.