За матеріалами статті на тему «Частка гліфосату у виробництві та переробці цукрових буряків, стійких до гліфосату (Beta vulgaris)» («Fate of Glyphosate during Production and Processing of Glyphosate-Resistant Sugar Beet ( Beta vulgaris)») журналу «Журнал сільськогосподарської та харчової хімії» («Journal of Agricultural and Food Chemistry»), січень 2019 р.

Генетично модифіковані (ГМ) культури стали невід’ємною частиною сільськогосподарського виробництва в США та у всьому світі. Існує великий розрив у розумінні та схваленні генетично модифікованих культур між споживавами та науковцями. Нещодавно проведений метааналіз Національної академії наук встановив, що правильне використання стійких до дії гербіцидів культур не викликає негативного впливу на навколишнє середовище, не було жодних доказів того, що споживання продуктів, отриманих із гербіцидостійких культур, негативно впливає на здоров’я людей чи тварин, включаючи будь-які порушення мікрофлори кишечника. Незважаючи на це, останнім часом деякі правозахисні організації висловлюють занепокоєння з приводу можливих залишків пестицидів у посівах та, як наслідок, і в продуктах харчування. Станом на 2015 рік налічувалося десять комерційно доступних генетично модифікованих культур, які мають різноманітні ознаки, включаючи стійкість до гербіцидів чи комах або зменшення потемніння фруктів, які займали 12% сільгоспугідь у всьому світі. Однією з таких культур є стійкий до дії гліфосату (GR) цукровий буряк (Beta vulgaris).

Цукровий буряк — технічна культура, яка вирощується на комерційній основі як гібрид, а сахароза є основним первинним компонентом кореня. Цукровий буряк — дворічна рослина, якій потрібно два роки, щоб завершити свій біологічний життєвий цикл та отримати насіння, але збирання врожаю, як правило, проводиться після першого року, коли вміст сахарози найбільший. У США цукрові буряки вирощуються насамперед у штатах Міннесота, Айдахо, Північна Дакота, Мічиган, Монтана, Небраска, Вайомінг, Каліфорнія, Колорадо та Орегон, які спільно виробляють майже 50% цукру-сирцю, споживаного в Штатах. Решта забезпечується за рахунок тростинного цукру, виробленого в США або імпортованого з тропічних країн. Боротьба з бур’янами — одна з головних проблем виробництва цукрових буряків. Цукровий буряк — культура, яка росте досить повільно та чутлива до конкуренції з бур’янами. Таким чином, було розроблено комплексні програми боротьби з бур’янами у виробництві звичайних цукрових буряків, які включали більше 120 гербіцидів із використанням 19 діючих речовин, зареєстрованих для використання на посівах даної культури. У виробництві звичайних цукрових буряків використовувалися гербіцидні суміші, що містять до п'яти діючих речовин, у поєднанні з механічною боротьбою з бур’янами на 50% посівних площ. Діючі речовини, що входять до складу післясходових гербіцидів, включали фенемедифам, клопіралід, етофумезат, десмедифам, клетодім та трифлусульфурон-метил.

Гліфосатостійкий (GR) цукровий буряк був виведений в 2007 році і на сьогоднішній день є найшвидше прийнятою технологією генетичної модифікації. Зараз у США майже 100% площ засіваються GR буряками. Ці сорти виражають стійкий до гліфосату мікробний ген CP4 для 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатної синтази (EPSPS), приманки для гербіциду. Після виведення гліфосатостійких (GR) цукрових буряків, виробники почали покладатися в основному на гліфосат у боротьбі з бур’янами. Прості програми включають від одного до трьох застосувань гліфосату для сезонної боротьби з бур’янами на посівах гліфосатостійких цукрових буряків. Поряд із кращими методами боротьби з бур’янами та значним скороченням пошкоджень рослин, технологія генетичної модифікації має додаткові переваги для навколишнього середовища та виробництва. Ці переваги включають п’ятикратне скорочення загальної кількості застосовуваних діючих речовин, зменшення впливу на навколишнє середовище більш ніж на 90%, екологічно досконалу виробничу практику, таку як ґрунтозахисне землеробство, що зменшило викиди вуглецю на 83%, скорочення споживання палива та пов'язаних із ним викидів на 50%, зменшення використання води більше ніж на 30% та підвищення ефективності використання земель (підвищення врожайності більше ніж на 30%).

Гліфосат [N-(фосфонометил)-гліцин] був розроблений американською компанією «Monsanto» в 1970 році. Гербіцид інгібує 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатну синтазу (EPSPS), білок, який каталізує утворення 5-енолпірувілшікімата-3-фосфату із шікімат-3-фосфату та фосфоенолпірувату. Це інгібування порушує синтез ароматичних амінокислот (фенілаланіну, тирозину та триптофану) та викликає загибель рослин. Протягом декількох днів листя рослин стає хлоротичним, а самі рослини гинуть вже за декілька тижнів. EPSPS є приманкою для гербіцидів. Крім того, гліфосат не накопичується у більшості ґрунтів через швидку адсорбцію органічної речовини ґрунту та деградацію за участі ґрунтових мікроорганізмів, що надає йому особливо сприятливий екологічний профіль.

Фізичні та хімічні властивості гліфосату дозволяють гліфосату переходити до метаболічних стоків разом з асимілятами, а також він не піддається швидкій метаболічній деградації в рослинах. Хоча транслокація гліфосату обмежувалася у звичайному цукровому буряку через швидку фітотоксичну реакцію на цій культурі, для гліфосатостійких цукрових буряків це більше не є обмежуючим фактором, оскільки гербіцид більше не впливає на такі рослини. Отже, значна кількість гліфосату може потенційно накопичуватися в коренях цукрових буряків і залишатися вихідною молекулою протягом тривалого часу.

Про залишки гліфосату в культурі та харчових продуктах практично нічого не повідомлялося. Опубліковані дослідження були проведені на залишках гліфосату в GR сої (Glycine max) та канолі (Brassica napus), невеликі рівні гліфосату накопичувалися в квасолі, як метаболічному стокові рослини. Ці рослини також метаболізували частину гліфосату в основний метаболіт амінометилфосфонової кислоти (AMPA), але ця метаболічна деградація в інших рослинах, як правило, була повільнішою або взагалі відсутньою. Нещодавнє дослідження кукурудзи не виявило накопичення гліфосату в насінні, але виявило розпад невеликої кількості гліфосату в AMPA.

Перед початком комерційного виробництва ГМ культур у США, вони повинні пройти суворі випробування та дотримуватися вказівок щодо залишків пестицидів, встановлених Агентством з охорони навколишнього середовища (EPA) відповідно до Закону США про контроль за токсичними речовинами (21 USC § 346a (2015)) та Зводу федеральних нормативних документів (40 CFR § 180.364 (2014)). Відповідно до EPA, максимальний рівень залишків (MRL) гліфосату в пагонах та коренях буряка становить 10 мкг/г свіжої маси (FW) та 25 мкг/г FW у буряковому жомі. Бурякова патока (меляса) в документі не вказана. Допустима межа споживання гліфосату, визначена EPA, становить 1,75 мг/кг маси тіла. Європейська комісія з питань безпеки харчових продуктів встановила аналогічні рекомендації щодо MRL гліфосату в цукрових буряках на рівні 15 мкг/г FW (Регламент (ЄС) № 396/2005), та критичну стандартну дозу (межу споживання) на рівні 0,5 мг/кг маси тіла (Європейська адміністрація з продовольчої безпеки, 2015; DOI: 10.2903 / j.efsa.2015.4302).

Основна мета дослідження полягала у визначенні частки гліфосату в гліфосатостійких (GR) цукрових буряках після звичної практики використання гербіциду протягом вегетаційного періоду та під час переробки буряків у цукор. Для досягнення цієї мети визначали рівень гліфосату у пагонах та коренях до та після кожного застосування гліфосату та безпосередньо перед збиранням, а також у зразках, отриманих під час переробки буряків у цукор на заводі в штаті Колорадо. Здатність коренів цукрових буряків виділяти гліфосат була перевірена кількісним визначенням гліфосату під час зрошення цукрових буряків, вирощуваних у тепличних умовах.

Хід експерименту

Польове дослідження. Для дослідження було обрано два поля, розташовані на півночі штату Колорадо, США. Поле 1 було засіяно цукровими буряками сорту HM 9617 15 квітня 2017 року. Гліфосат (825 г/га) та клопіралід (110 г/га) застосовувалися 1 червня, коли буряк знаходився на стадії 4-6 листочків. 28 червня на невеликій частині поля, яка не оброблялася 1 червня, було застосовано гліфосат (870 г/га) та метолахлор (1,07 кг/га). Азот (78,5 кг/га) було внесено в міжряддя в кінці червня 2017 року. Дифеноконазол та пропіконазол (по 130 г/га кожен) застосовувалися на початку серпня 2017 року для захисту посівів від борошнистої роси.

Поле 2 було засіяно цукровими буряками сорту Crystal W322NT 17 квітня 2017 року. Гліфосат (1,26 кг/га) та клетодим (140 г/га) застосовувалися 30 травня 2017 року, коли буряк знаходився на стадії 4-6 листочків. Гліфосат (1,26 кг/га), клетодим (140 г/га) та  метолахлор (1,07 кг/га) застосовувалися 22 червня 2017 року. Азоксистробін застосовувався в дозі 0,15 г/га 7 червня. У кінці червня рослини було підживлено азотом (112 кг/га) та фосфатом (45 кг/га). Фунгіциди дифеноконазол та пропіконазол (по 130 г/га кожен) застосовувалися на початку серпня для захисту посівів від борошнистої роси.

Зразки відбиралися 26 травня, 6 червня, 21 та 28 червня 2017 року до та після кожної обробки (Графік 1). Додаткові зразки були зібрані в середині сезону 12 липня та 6 жовтня безпосередньо перед збиранням. На кожну дату з обох полів було хаотичним чином відібрано по шість рослин, за винятком 21 та 28 червня, коли зразки відбиралися лише з поля 2. Відібрані зразки розділялися на пагони та корені, потім поміщалися безпосередньо в сухий лід, після чого зберігалися в морозильній камері при -80°C протягом 4 годин до початку подальшої їх обробки.

Графік 1. Зразки, зібрані для визначення залишків гліфосату в сезоні 2017 року. Зелений колір ліворуч — зразки, зібрані з двох полів на півночі Колорадо в залежності від доз гліфосату на цих полях. Лише на полі 2 було проведено повторне внесення гліфосату, тому було відібрано лише одне поле до та після цього застосування. Праворуч — спрощена схема переробки буряків у цукор зі зразками, зібраними для визначення залишків зеленого кольору.

Тепличний експеримент зі зрошенням. Чорні пластикові контейнери (діаметром 6,5 см) були заповнені пастеризованим парою ґрунтовим субстратом (45-55% торфу, вермикуліту, кори та доломітового вапна) та зрошувалися для підтримки належного зволоження ґрунту. Насіння цукрового буряка сорту Crystal W322NT було висаджено по 1 насінині на контейнер на глибині приблизно 1 см. Потім сходи вирощувалися в тепличних умовах при температурі 27 ± 2°С, відносній вологості 50% та тривалості світлового дня 16 год протягом 4-5 тижнів або до тих пір, поки рослини не досягали фази 2-3 повністю розвинених листочків. Рослини удобрювалися кожні 2-3 тижні добривом Peters Professional 20 - 20 - 20 при нормі 200 мкг/мл. Коли рослини досягли 5 тижнів, вони були пересаджені в нові контейнери, що містили інертне середовище Profile Field & Fairway. Це середовище не містило будь-яких органічних речовин і було вибрано для полегшення виходу гліфосату, виділеного з коренів. Їх зберігали в тепличних умовах при температурі між 21 і 28°C при тривалості світлового дня 12 год. Буряки обприскувалися гліфосатом (1,26 кг/га). Потім рослини щодня поливали живильною сумішшю Хогланда в концентрації ¼ (100 мл).

Обробка зразків. Розморожені корені зібраних із поля цукрових буряках розрізали на шматки 2,5 см, поміщали в блендер і гомогенізували дистильованою (DI) водою (1:1) протягом 4 хв на максимальній швидкості. Гомогенат фільтрували через чотири шари марлі для відділення соку від м’якоті (жому). Фільтрат (дифузійний сік) відбирали. Пагони подрібнювалися у ступці з товкачем під рідким азотом. Подрібнену тканину (2,5 г) змішували з 5 мл дистильованої води і перемішували протягом 10 хв. Потім суміш центрифугували при 4000 об. протягом 5 хв, а супернатант використовували для аналізу.

Зразки фракцій цукрових буряків, перероблених на заводі Western Sugar Cooperative у штаті Колорадо, зберігалися при температурі -80°C до початку аналізу (Графік 1). Зразки включали віджатий жом, дифузійний сік, сатураційний сік, випарений сироп, кристалічний цукор та патоку (мелясу) (Графік 1). Зразки цукру та патоки (меляси) розбавлялися у дистильованій воді 25 мг/мл. Дифузійний та сатураційний сік аналізувалися без змін. Віджатий жом змішувався у пропорції 1:3 із дистильованою водою і гомогенізувався в блендері протягом 4 хв на максимальній швидкості, а потім гомогенат фільтрували через чотири шари марлі, щоб відокремити рідину, яка була використана для аналізу. Випарений сироп також розбавляли в дистильованій воді у співвідношенні 1:1. Зрошувані зразки обробляли без розбавляння.

Аналіз гліфосату. Гліфосат та AMPA кількісно визначалися у зразках буряків за допомогою дериватизації хлоридом флуоренілметилоксикарбонілу (FMOC). Коротко кажучи, 400 мкл аліквоти 5%-го розчину борату додавали до 800 мкл зразка в 2 мл пробірку Еппендорфа і перемішували. 400 мкл аліквоти дериватизуючого агенту (10 мг FMOC-Cl, розчиненого в 1 мл ацетонітрилу) додавали в пробірки і суміш перемішували. Зразки витримувалися при кімнатній температурі протягом 4-16 годин. Калібрувальні криві гліфосату та його первинного метаболіту AMPA були побудовані з отриманого залишку (5 мкг/мл) та розчинених у воді до концентрацій 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 та 1 мкг/мл вихідних розчинів. Зразки центрифугувалися при 10 000 об. протягом 5 хв і фільтрувалися через нейлоновий вприскувальний мембранний фільтр 0,25 мкм перед аналізом на Shimadzu LCMS 8040 (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD 21046).

Розчинник А складався з води з 0,01 М ацетату амонію, а розчинником В був ацетонітрил. На першій хвилині градієнт починався при 10% B і лінійно збільшувався до 99% B до 5 хв. Рухома фаза залишалася на рівні 99% B до 8 хв, потім поверталася до 10% B через 8,5 хв і підтримувалась на рівні 10% до кінця експерименту через 11 хв. Швидкість потоку склала 0,4 мл/хв. Кожен зразок аналізували як обсяг проби 2 мкл. Час утримування для AMPA та гліфосату склав 4,99 та 4,72 відповідно. Ефективність вилучення становила 90% для AMPA і 99% для гліфосату. Межа виявлення (LOD) та межа кількісного визначення (LOQ) для гліфосату становили 2,76 пг/мкл та 8,36 пг/мкл; LOD і LOQ для AMPA були 7,4 пг/мкл і 22 пг/мкл, розраховані виходячи зі стандартного відхилення реакції та нахилу калібрувальної кривої.

Статистичний аналіз. Було проведено багатовимірний факторіальний дисперсійний аналіз (ANOVA) та порівняння середніх значень. Аналіз даних коренів, пагонів та заводських зразків проводили окремо. У всіх випадках змінною реакції була кількість виявленого гліфосату. Для коренів та пагонів основними змінними були терміни збирання та поле. Для заводських зразків змінними були тип зразка та завод. Для польових зразків n = 6, а для заводських зразків n = 3.

Результати та обговорення

У сезоні 2017 року в Колорадо тиск бур’янів був меншим середнього рівня. Поле 1 вимагало лише одного застосування гліфосату, тоді як поле 2 — двох застосувань для контролю видів бур’янів; зазвичай поля обробляються 2-3 рази на рік. Як зазначено на Графіку 1, зразки збирали з полів приблизно за 5 днів до та після кожної обробки. Два додаткових зразки були відібрані в середині сезону і безпосередньо перед початком збирання.

Рівні гліфосату та вирощені в польових умовах цукрові буряки. Перед застосуванням гліфосат знаходився нижче межі виявлення у листі та коренях цукрових буряків (дані, що не суттєво відрізняються від нуля, р < 0,05). Відповідно до інших видів рослин, цукровий буряк легко поглинав гліфосат через 5 днів після його позакореневого внесення, при цьому від 2 до 4 мкг гліфосату/г свіжої маси (FW) було виявлено в пагонах буряків на обох полях (Графік 2А). Діюча речовина проникла до кореня з вмістом між 2 і 4 мкг гліфосату/г FW (Графік 2В). Ця масивна транслокація гліфосату пов'язана з його унікальною здатністю рухатись по фотосинтатах до метаболічних стоків. До наступної дати відбору проб у полі 2, через 15 днів, більша частина гліфосату вийшла з рослин. Аналогічна схема поглинання, транслокації та елімінації спостерігалася у зразках, зібраних із поля, яке було двічі оброблено гліфосатом. Як результат, рівень гліфосату продовжував знижуватися у коренях до початку збирання із концентраціями 1,5 пг/г свіжої маси (FW) у полі 1 (одна обробка) та 32 пг/г FW у полі 2 (дві обробки) під час збирання. Рівні суттєво відрізнялися між різними термінами збирання та між полями на останніх двох датах збирання (р < 0,05), відображаючи різну кількість обробок гліфосатом кожного поля.

АМРА була нижче межі виявлення у всіх зразках, що не дивно, оскільки швидкий розпад гліфосату в АМРА було виявлено лише в декількох видів. На сьогоднішній день нічого не повідомлялося про виділення гліфосату з коренів цукрових буряків. Однак є дані про те, що гліфосат може виділятися з коренів деяких рослин (наприклад, пшениці, сої, ріпаку, бавовни, кукурудзи та польового хвоща). Тому можна зробити припущення, що швидке зникнення гліфосату з тканин оброблених рослин цукрового буряка пов'язане з його виділенням із кореня в ґрунт, як це було показано на прикладі пшениці, де він (гліфосат) швидко розпадається під дією ґрунтових мікроорганізмів.

Виділення гліфосату з цукрового буряка. Щоб визначити, чи виділився гліфосат із коренів цукрових буряків через зрошення зразки збиралися протягом 21 дня після позакореневого застосування гліфосату. Розчин для поливу додавали безпосередньо в інертне середовище горщика для усунення стікання з листя. Гліфосат було виявлено на досить стійкому рівні в зібраних зразках після щоденного поливу протягом перших 11 днів, із середнім показником 218 ± 40,5 мкг гліфосату/добу. Після 11 днів рівень виявленого гліфосату швидко опустився до межі виявлення. Цей процес триває довше в польових умовах, про що свідчить кількість гліфосату в корені через 1 тиждень після обробки (Графік 2В). Різниця в тривалості виділення більшої частки гліфосату між дослідженням зрошення та польовим експериментом становить від 11 днів для тепличного експерименту та до 21 дня для польових умов, що, ймовірно, пов'язано з різною кількістю води, що подається до коренів. У тепличних умовах цукрові буряки щодня зрошувалися, тому гліфосат виділявся швидше з коренів.  У польових умовах буряки поливалися рідше і виділений гліфосат приєднувався до органічної речовини в корені.

Рівні гліфосату під час переробки цукрових буряків. Під час переробки цукрових буряків у кристалічний цукор контролювалася частка гліфосату. Процес включає гомогенізацію коренів і фільтрування гомогенату для відокремлення віджатого жому від дифузійного соку. Цей сік перероблявся на етапі сатурації для видалення білків та отримання сатураційного соку, який переходить у випарений сироп. Потім цукор кристалізується з сиропу і відокремлюється від патоки (меляси), що залишається (Графік 1). Найвищий рівень гліфосату спостерігався в дифузійному соку, першому продукті переробки, — 223 пг/мл (Графік 3). На етапі сатурації більша частина залишку гліфосату успішно видалилася, а в сатураційному соку залишилося 3,8 пг/мл гліфосату. Це значення статистично не відрізнялось від нуля (p < 0,05). У подальшій переробці соку видалилися всі сліди гербіциду, при цьому в сатураційному соці, випареному сиропі та гранульованому цукрі не було виявлено гербіциду (Графік 3). У віджатому жомі було виявлено слід гліфосату (102 пг/г), що є щонайменше в 200 разів нижчим значенням за максимально допустимий в США рівень — 25 мг/кг. У мелясі було виявлено 36,3 пг/г гліфосату, що є щонайменше у 800 разів нижчим значенням за затверджений рівень для патоки цукрової тростини, що не було статистично відмінним від нуля (р < 0,05). Слід зазначити, що як буряковий жом, так і меляса використовуються виключно для кормів для тварин.

Можна зробити висновок, що гліфосат — широковідомий інструмент для боротьби з бур’янами у виробництві цукрових буряків. Його здатність до транслокації та виділення з коренів забезпечує дуже низький рівень гербіциду в цукрових буряках під час їх збирання. Більше того, під час переробки буряків у кристалічний цукор видаляється будь-який слід цього гербіциду з кінцевого продукту.